在16世紀作品展區裡我們首先從威尼斯畫派中最偉大的畫家提香說起。這幅《傑羅拉莫肖像畫》是他1510年的早期作品，對於這個名稱學術界還存在很大爭議，因為沒人說得清畫中人物到底是誰，所以更為普遍的叫法是《棉衣袖男子》。畫中人物側身倚在一根橫欄上，很好地解決了半身人像的姿態問題，這種方式後來被倫勃朗等畫家效仿。欄杆上刻著T和V兩個字母，據推測應該就是畫家的名字Tiziano Vecellio的縮寫。
更著名的一幅是提香1523年完成的《酒神巴庫斯和阿里阿德涅》，此時正值他繪畫事業蒸蒸日上的時期。畫面最左邊的是古希臘神話中的阿里阿德涅，她是克裡特國王彌諾斯的女兒，幫助忒修斯走進迷宮殺死牛頭人身怪物彌諾陶洛斯。本來她是傾心於忒修斯的，但忒修斯夢見酒神巴庫斯聲稱已擁有阿里阿德涅，便狠心將她拋棄在納克索斯島上。忒修斯走後，酒神帶著載歌載舞的隊伍來到島上迎親，此畫表現的就是迎親的場景。酒神從右邊走來，他頭戴葡萄藤，身披酒紅色披風，從車上一躍而下，將阿里阿德涅的金冠變成天上的一圈星星（畫面左上角）。兩個女祭司手持鐃鈸跳著舞，一名男子身纏蟒蛇，一名則舉著牛腿，半人半獸的小薩梯拖著牛頭，車前的印度豹暗指酒神在東方的戰績，而此時的阿里阿德涅則陷入驚恐。
提香是位長壽的畫家，一生活了88歲，下面這幅是他晚年的作品，71歲時開始創作，87歲才最終完成，它就是《亞克託安之死》。畫中故事取材於古羅馬詩人奧維德（Ovid，公元前43-公元17）的《變形記》。亞克託安是個獵人，有一天他在林中撞見正在洗澡的狩獵女神黛安娜（在古希臘神話中叫阿耳忒彌斯）。黛安娜一氣之下將他變成一隻雄鹿，結果悲劇發生了，亞克託安的獵犬不認識變身雄鹿的主人，撲上去將自己的主人咬死了。畫面左邊的黛安娜似乎正在彎弓射箭，但是畫中並沒有表現出箭，甚至弓上都沒有畫弦，因此有人認為這幅畫並未畫完。
在義大利，除了「文藝復興三傑」外，還有個「威尼斯三傑」，他們是提香、丁託列託（Tintoretto，1518-1594）和保羅·委羅內塞（Paolo Veronese，1528-1588）。其中委羅內塞是提香的學生，他從提香那裡學到了對色彩的運用，並將自然主義風格發揮到極致。委羅內塞最擅長的是對大場面的把控，他最有名的作品幾乎都擠滿了人，比如我們看到的這幅《大流士的家眷跪在亞歷山大面前》。公元前333年，亞歷山大大帝（Alexander the Great，公元前356-公元前323）在伊蘇斯戰役中擊敗波斯國王大流士三世（Darius III，公元前380-公元前330），俘虜了大流士三世的母親、妻子和兩個女兒。有意思的是，當亞歷山大帶著手下走到四位女眷面前時，大流士三世的母親將人群中較高大的一位誤認作亞歷山大，於是跪地向其乞求寬恕。此時的亞歷山大非但沒有生氣，反而寬宏大量地指著那位手下對大流士三世的母親說「他也可以代表亞歷山大」。畫面中身穿紅衣的就是亞歷山大，他右手向前做安撫狀，左手指著身旁穿黃衣的那位被誤認的手下。
15世紀，文藝復興運動還主要在義大利發展，進入16世紀後則迅速蔓延至幾乎整個歐洲。揚·戈塞特（Jan Gossaert，1478-1532）被認為是第一個將義大利文藝復興時期用裸體人物描繪歷史和神話的主題風格介紹到低地國家的佛蘭德藝術家。顯然，那個時代的低地國家還比較保守。不過，我們今天在這裡看到的並非一幅裸體畫，而是他繪製於1510-1515年的傳統宗教畫《三賢王的膜拜》。
這是為布魯塞爾附近的聖阿德裡安修道院創作的聖母堂祭壇畫。畫面表現的是東方三博士膜拜聖嬰的場景，中間跪著向聖母子行禮的是嘉士伯，他身後手持寶物的站立者為梅爾基奧，左邊雙手託著寶物的是巴爾退則，左後方穿紅袍的灰鬍子長者為聖約瑟夫。畫家採用明亮的色彩描繪出許多細節，包括華麗的服飾和精緻的金屬工藝品，以及與之形成鮮明對比的破損的地面和廢墟般的建築。畫面的縱深很遠，背景中在不同的距離上出現諸多人物和建築，空間感非常強烈。
小漢斯·霍爾拜因（Hans Holbein the Younger，1497-1543）是德國文藝復興藝術的代表人物，他創作的範圍很廣，不僅有各種題材的繪畫，還包括節日裝飾和珠寶設計等，但其最擅長的還是肖像畫。他很早便獲得業界認可，成名後前往英國發展，成為亨利八世的宮廷畫家。
這幅《使節》繪製於1533年，畫中的兩個人物都是法國派駐英國的使臣，從二者服裝上的差異可以看出不同的性格，左邊的丹特維爾（Jean de Dinteville，1504-1555）開朗活潑，右邊的塞爾夫（Georges de Selve，1508-1541）內斂穩重，塞爾夫同時也是法國拉沃爾的主教。看似凌亂的擺設實際暗示出二者對科學與藝術的興趣。託架上覆蓋著安那託利亞地毯，上面是測量星象與時間的各種儀器。下方一把斷了弦的詩琴和打開的馬丁·路德的讚美詩暗指英法在宗教信仰上的分歧，1533年英國國會立法脫離羅馬教廷，成立了英國國教會。懸在下方的變形的骷髏頭象徵死亡，需要在畫的左下方距離較遠的位置才能看出來。小漢斯·霍爾拜因非常喜歡運用符號暗示，畫中通過兩層木架和地面體現出三層境界，上層木架擺著的星象儀代表天堂，下層木架的地球儀、書和琴代表現實世界，地上的骷髏代表死亡。關於這個變形的骷髏頭，有一種說法認為這幅畫原本設計的是要掛在樓梯左面側牆的，這樣的話觀者在上樓梯的過程中最先看到這幅畫是在它的左下方較遠的位置，此時先注意到的就是這個在那種視覺角度上反而恢復了常態的骷髏。這樣的做法讓人不得不想到是一種炫技，但也的確會讓人拍案叫絕，忍不住對這幅畫多議論幾句。