Cell丨流感病毒RNA聚合酶完整的轉錄周期模型

撰文 | 鹹姐

責編 | 兮

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的全球性嚴重傳染性疾病。流感病毒屬於正粘病毒科流感病毒屬，是一種RNA病毒。流感病毒的基因組由8個單負鏈RNA片段（病毒RNA，vRNA）組成，共編碼了11個蛋白，其中，流感病毒RNA聚合酶是由前3個片段所編碼的。流感病毒RNA聚合酶是由酸性蛋白（PA）、鹼性蛋白1（PB1）和鹼性蛋白2（PB2）三個亞基組成的異源三聚體複合物，PB1亞基主要參與病毒基因組的複製過程，而PB2亞基主要負責與宿主pre-mRNA帽狀結構結合，協助完成內切酶的剪切過程。流感病毒RNA聚合酶與核蛋白（NP）、vRNA一起構成核糖核蛋白體（vRNP）。流感病毒進入宿主細胞後，vRNP被運送到細胞核與轉錄中的Pol Ⅱ結合，病毒聚合酶開始進行「初級」轉錄，產生病毒mRNA，進而合成病毒蛋白【1,2】。

由於病毒蛋白質的合成依賴宿主細胞的翻譯體系，流感病毒mRNA需要同時具備可供宿主細胞翻譯體系識別的5』-帽狀結構和3』-poly(A)尾，因此病毒mRNA的轉錄是通過一種獨特的稱為「搶帽」（cap-snatching）的過程發生的，在這個過程中，來自宿主pre-mRNA的短帽寡聚物（長度約為10-15 nt）被PB2亞基「搶奪」，在PA亞基中被內切酶裂解，然後被PB1亞基用於啟動mRNA的合成。病毒RNA聚合酶在vRNA 5』-端附近的寡聚-U延伸處的停頓，導致了自身聚腺苷酸化。因此，翻譯能力強的病毒mRNA不需要病毒編碼的加帽酶，也不需要宿主的聚腺苷酸機制。整個複製過程包括將vRNA準確的全長拷貝不經修飾的合成為互補RNA（cRNA），然後逆轉回子代vRNA。初生的複製體會立即與核蛋白整合在一起，形成完整的vRNP或互補RNP（cRNP）。相反，病毒的mRNA則並沒有被這樣包裝，而是被當作宿主的pre-mRNA被進一步剪接，並通過宿主的細胞機制輸出到細胞質中【3】。此外，有研究發現，一個單一的初級vRNP可以在沒有額外的病毒成分的情況下進行轉錄【4】，而在翻譯抑制劑放線菌酮存在的情況下病毒mRNA持續積累也表明單個vRNP可以進行多輪轉錄【5】。在真正的流感病毒感染過程中，這種潛在的高效回收機制與從相對較少的vRNP中快速生成大量病毒mRNA的需求是一致的。

由此可見，流感病毒mRNA的轉錄過程有著其獨特且複雜的機制，儘管多年的研究逐漸揭開了這一過程的部分面紗，但是從整體上全面而完整的了解流感病毒mRNA的轉錄過程仍然是解讀流感及開發流感有效藥物的必要過程。

2020年4月17日，來自法國歐洲分子生物學實驗室的Stephen Cusack研究團隊在Cell上在線發表題為 A Structure-Based Model for the Complete Transcription Cycle of Influenza Polymerase 的文章，基於轉錄活躍的蝙蝠A型流感（FluA）聚合酶的高解析度冷凍電鏡結構，提出了流感聚合酶合成mRNA的整個轉錄周期的詳細機制模型，該結構涵蓋了從轉錄起始前到延伸和終止的整個轉錄周期，以及產物分離和模板再循環利用，為改善靶向流感病毒mRNA合成過程的抑制劑的設計提供了重要的基礎。

本文的研究人員在率先添加了ATP和GTP，隨後添加了CTP和一個不可水解的UTP模擬物（UpNHpp）後，利用一個延伸的18+3鹼基長度的模板、帶帽的15鹼基的引物和14鹼基長度的vRNA 5』-端激活的「掛鈎」序列，建立了在模板轉位後使RNA聚合酶停止的方法，通過冷凍電鏡技術，獲得了轉錄中的RNA聚合酶在不同連續狀態中的結構（圖1）。

圖1 流感病毒RNA聚合酶轉錄周期的結構

 

將延伸狀態與啟動前狀態的結構進行比較發現，蝙蝠FluA聚合酶的啟動-延伸轉變表現出與先前描述的FluB聚合酶相同的特徵構象變化，這些變化包括：1）啟動迴路的完全擠壓和模板出口通道的開啟；2）涉及PB1 β-功能區大約28°旋轉的啟動子摺疊；3）PB1/667-681重新摺疊並形成帶有β-功能區的三股片層；4）PB1拇指結構域和相關的PB2-N結構域向外旋轉約5°；5）置換PB2/37-44，允許雙相延伸；6）通過在最後一對雙重鹼基上堆疊PB2 lid結構域Tyr205和PB1/Arg706實現雙鏈分離。

這個結構揭示了流感病毒RNA轉錄重要的新特性。首先是模板從5』-端「掛鈎」到活性位點的有序直接連接；其次是觀察到了模板沿著出口通道前進並繞過PB2-N1結構域，通過活性位點轉位後，其3』-末端的5個核苷酸重新結合到聚合酶PB1拇指和PA-C結構域之間的部分隱藏的「口袋」中，即二級3』-末端結合位點。此外，這一系列結構精確地解釋了流感mRNA聚腺苷酸化的停頓和滑脫機制，即第17位尿苷在活性位點+1的位置上來回翻轉進出，活性位點空腔中的模板的長度在每一輪ATP結合之間存在9-10個鹼基之間的交替而沒有任何淨移位。因此，與延伸過程中的常規轉位相反，在聚腺苷酸化時，只有產物從活性位點腔中轉出。與此同時，該結構顯示，通過在mRNA合成過程中緊緊抓住模板的兩端，流感病毒聚合酶既能保護模板不被降解，又能有效地回收模板，改造啟動子，並啟動下一個轉錄周期，從而使得一個RNP可以高效地產生多個mRNA。

綜上所述，根據廣泛的、高解析度的冷凍電鏡結構數據顯示的連續的流感病毒RNA聚合酶在轉錄過程中的結構，本文提出了一個全面且連貫的流感病毒RNA聚合酶完整的轉錄周期模型，對流感病毒模板經過活性位點後的軌跡、聚腺苷酸化的機制以及模板的回收是如何發生的有了新的認識，從而為流感的治療提供了新的思路和方向。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.061

1. AREA E, MARTIN J, GASTAMINZA P, et al. 3D structure of the influenza virus polymerase complex:localization of subunit domains[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (1) :308-313.

2. ENGELHARDT O G, FODOR E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection[J].Rev Med Virol, 2006, 16 (5) :329-345.

3. Reich S, Guilligay D, Pflug A et al. Structural insight into cap-snatching and RNA synthesis by influenza polymerase. Nature. 2014, 516(7531):361-6.

4. Jorba, N., Coloma, R., and Ortı´n, J. Genetic trans-complementation establishes a new model for influenza virus RNA transcription and replication. PLoS Pathog. 2009, 5, e1000462.

5. Vreede, F.T., Jung, T.E., and Brownlee, G.G. Model suggesting that replication of influenza virus is regulated by stabilization of replicative intermediates. J. Virol. 2004, 78, 9568–9572.