實驗室常用染色液配方

2021-02-18 世界印染科技

實驗室常用染色液配方

1、呂氏(Loeffler)美藍染色液
A液：美藍(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升

B液：氫氧化鉀(KOH) 0.01 克蒸餾水 100 毫升分別配製A液和B液，然後混合即成。

2、齊氏(Ziehl)石炭酸復紅染色液
A液：鹼性復紅(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精 10.O 毫升
B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸餾水 95 毫升

將鹼性復紅溶於95%酒精中，配成A液。將石炭酸溶於蒸餾水中，配成B液。將兩者混合即成。

3、結晶紫染色液(Huclker改訂)

A液：結晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精 25.0 毫升
B液：草酸銨(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸餾水 100 毫升

將結晶紫研細後，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。將草酸銨溶於蒸餾水，配成B液。兩液混合即成。

4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鑑別染色用)

碘 1.0克碘化鉀 2.0克蒸餾水 300毫升

先將碘化鉀溶於少量蒸餾水中，再將碘溶於碘化鉀溶液中，溶時可稍加熱，最後加足蒸餾水量。

5、番紅染色液(革氏鑑別染色用)

番紅O(Safranin O) 2.0克蒸餾水 100毫升

6、孔雀綠染色液(芽孢染色用)

孔雀綠(Malachite green) 5.0克蒸餾水 100毫升先將孔雀綠研細，加少許95%酒精溶解，再加蒸餾水。

7、Dorner黑素液(英膜染色用)

黑素(Nigrosin) 10.0克蒸餾水 100毫升福馬林(40%甲醛) 0.5毫升將黑素在蒸餾水中煮沸5分鐘，加入福馬林作為防腐劑，用玻璃棉過濾。

8、剛果紅染色液剛果紅(Congo red)

2.0克蒸餾水 100毫升

9、稀釋結晶紫染液(放線菌染色用)

結晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸餾水 95.0

10、乳酸石碳酸棉藍染色液（真菌製片，短期保存）

石炭酸 10.0克甘油 20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉藍 0.02克蒸餾水 10.0毫升將碳酸加在蒸溜水中加熱溶化，加入乳酸和甘油，最後加入棉藍，溶解即成。

11動物組織石蠟切片染色方法
蘇木精-伊紅(HE)染色：二甲苯Ⅰ, Ⅱ各10 min，依次進入無水乙醇、950 mL/L, 900 mL/L, 800 mL/L及700 mL/L的酒精各5 min，蒸餾水洗；入蘇木精染液10 min，鹽酸酒精分色4 s，自來水洗10 min；依次入700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精各5 min，入伊紅染液染色10 min；入950 mL/L及無水乙醇Ⅰ, Ⅱ各5 min, 以二甲苯透明，中性樹脂封片.

一、常用染色液的配製
⒈ 碘-碘化鉀（I2-KI）溶液

能將澱粉染成藍紫色，蛋白質染成黃色，也是植物組織化學測定的重要試劑。
配方：碘化鉀2g ；蒸餾水300ml ；碘1g
先將碘化鉀溶於少量蒸餾水中，待全溶解後再加碘，振蕩溶解後稀釋至300mL，保存在棕色玻璃瓶內。用時可將其稀釋2-10倍，這樣染色不致過深，效果更佳。
⒉蘇丹Ⅲ（sudanⅢ或Ⅳ）

能使木栓化、角質化的細胞壁及脂肪、揮髮油、樹脂等染成紅色或淡紅色，是著名的脂肪染色劑。
配方：（1）蘇丹III或蘇丹Ⅳ乾粉0.1g ；95％酒精10ml ；過濾後再加入10ml甘油
（2）先將0.1g蘇丹III或IV溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。

（3）蘇丹III 70%乙醇的飽和溶液。

⒊ 1％醋酸洋紅（aceto carmine）酸性染料，

適用於壓碎塗抹製片，能使染色體染成深紅色，細胞質成淺紅色。
配方：洋紅1g ；45％醋酸100ml

煮沸2h左右，並隨時注意補充加入蒸餾水到原含量，然後冷卻過濾，加入4％鐵明礬溶液1～2滴（不能多加，否則會發生沉澱），放入棕色瓶中備用。

⒋ 改良苯芬品紅染色液（Carbol fuchsine）核染色劑。
配製步驟：先配成三種原液，再配成染色液。
原液A：3g鹼性品紅溶於100ml 70％酒精中。
原液B：取原液A10ml加入到90ml 5％石炭酸水溶液中。
原液C：取原液B 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福馬林（38％的甲醛）。
（原液A和原液C可長期保存，原液B限兩周內使用）
染色液：取C液10～20ml，加45％冰醋酸80～90ml，再加山梨醇1~1.8g，配成10％～20％濃度的石炭酸品紅液，放置兩周後使用，效果顯著（若立即用，則著色能力差）。
適用範圍：適用於植物組織壓片法和塗片法，染色體著色深，保存性好，使用2～3年不變質。山梨醇為助滲劑，兼有穩定染色液的作用，假如沒有山梨醇也能染色，但效果較差。

⒌中性紅（neutral red）溶液

用於染細胞中的液泡，可鑑定細胞死活。
配方：中性紅0.1g ；蒸餾水100ml

使用時再稀釋10倍左右。

⒍曙紅Y（伊紅，eosin Y）酒精溶液

常與蘇木精對染，能使細胞質染成淺紅色，起襯染作用。
配方：曙紅0.25g ；95％酒清100ml

也常用於95％酒精脫水時，加入少量曙紅溶液，其目的是在包埋、切片、展片、鏡檢時便於識別材料。

⒎釕紅（ruthenium red）染液

釕紅是細胞胞間層專性染料，其配後不易保存，應現用現配。

配方：釕紅5～10mg ；蒸餾水25-50ml

⒏龍膽紫（gentian violet）

為酸性染料，適用於細菌塗抹製片。

配方：龍膽紫0.2~1 g ；蒸餾水100ml

⒐苯胺蘭（aniline blue）溶液

為酸性染料，對纖維素細胞壁、非染色質的結構、鞭毛等，尤其是染絲狀藻類效果好。還多用於與真曙紅作雙重染色，對於高等植物多用於與番紅作雙重染色。

配方：苯胺蘭1 g ；35％或95％酒精100ml

⒑間苯三酚（phloroglucin）溶液

用於測定木質素。
配方：間苯三酚5g ；95％酒精100ml

註：此溶液呈黃褐色即失效。

⒒橘紅G（orange G）酒精溶液

為酸性染料，染細胞質，常作二重或三重染色用。

配方：橘紅G 1g ；95％酒精100ml

⒓番紅（safranin O）為鹼性染料

適用於染木化、角化、栓化的細胞壁，對細胞核中染色質、染色體和花粉外壁等都可染成鮮豔的紅色。並能與固綠、苯胺蘭等作雙重染色，與橘紅G、結晶紫作三重染色。
配方：（1）番紅水溶液番紅0.1或1 g ；蒸餾水100ml
（2）番紅酒精溶液番紅0.5或1 g ；50％（或95％）酒精100ml
（3）苯胺番紅酒精染色液
甲液番紅5 g +95％酒精50ml
乙液苯胺油20ml +蒸餾水450ml

將甲、乙二溶液混合後充分搖均勻，過濾後使用。

⒔固綠（fast green）又稱快綠溶液。

為酸性染料，能將細胞質，纖維素細胞壁染成鮮豔綠色，著色很快，故要很好的掌握著色時間。
配方：（1）固綠酒精液固綠0.1 g ；95％酒精100ml
（2）苯胺固綠酒精液固綠 1 g ；無水酒精 100ml ；苯胺油 4ml

配後充分搖勻，過濾後使用。現配現用效果好。

⒕蘇木精（hematoxylin）染液

蘇木精是植物組織製片中應用最廣的染料，是蘇木科植物蘇木的心材提取出來的。它是很強的細胞核染料，而且可以分化出不同顏色。配方很多，現舉海登漢氏（Heidenhain's）蘇木精染色液，又稱鐵礬蘇木精染色液。
配方：甲液（媒染劑）：硫酸鐵銨（鐵明礬）2-4g ；蒸餾水100ml
（必須保持新鮮，最好臨用之前配製）
乙液（染色劑）：蘇木精 0.5-1g ；95％酒精 10ml；蒸餾水 90ml
配製步驟：（1）將蘇木精溶於酒精中，瓶口用雙層紗布包紮，使其充分氧化（通常在室內放置兩個月後方可使用）。（2）加入蒸餾水，塞緊瓶口，置冰箱中可長期保存。
切片需先經甲液媒染，並充分水洗後才能以乙液染色，染色後經水稍洗再用另一瓶甲液分色至適度。

鐵礬蘇木精染液為細胞學上染細胞核內染色質最好的染色劑，但要注意甲液與乙液在任何情況下決不能混合。

⒖亞甲基藍染液

常用於細菌、活體細胞等的染色。

取0.1g亞甲基藍，溶於100ml蒸餾水中即成。

⒗詹納斯綠B（Janus green B）染液

將5.18gJanus 綠溶於100ml蒸餾水，配成飽和水溶液。用時需稀釋。稀釋的倍數應視材料不同而異。

⒘硫堇染液

取0.25克硫堇(也稱勞氏青蓮或勞氏紫)粉末，溶於100ml蒸餾水中，即可使用。使用此液時，需要用微鹼性自來水封片或用1%NaHCO3水溶液封片，能成多色反應。

18.黑色素液
水溶性黑素10g，蒸餾水100mL，甲醛(福馬林)0.5mL。可用作莢膜的背景染色。
19.墨汁染色液

國產繪圖墨汁40mL，甘油2mL，液體石炭酸2mL。先將墨汁用多層紗布過濾，加甘油混勻後，水浴加熱，再加石炭酸攪勻，冷卻後備用。用作莢膜的背景染色。

20.呂氏(Loeffier)美藍染色液
A液：美藍(methylene blue,又名甲烯藍)0.3g，95%乙醇30mL;
B液：0.01%KOH100mL。
混合A液和B液即成，用於細菌單染色，可長期保存。根據需要可配製成稀釋美藍液，按1∶10或1∶100稀釋均可。
21.革蘭氏染色液
(1)結晶紫(cristal violet)液：

結晶紫乙醇飽和液(結晶紫2g溶於20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸銨水溶液80mL。將兩液混勻置24h後過濾即成。此液不易保存，如有沉澱出現，需重新配製。
(2)蘆戈(Lugol)氏碘液：

碘1g，KI 2g，蒸餾水300mL。先將KI溶於少量蒸餾水中，然後加入碘使之完全溶解，再加蒸餾水至300mL，即成。配成後貯於棕色瓶內備用，如變為淺黃色能使用。
(3)95%乙醇：

用於脫色，脫色後可選用以下(4)或(5)的其中一項復染即可。
(4)稀釋石炭酸復紅溶液：

鹼性復紅乙醇飽液(鹼性復紅1g，95%乙醇10mL，5%石炭酸90mL)10mL，加蒸餾水90mL。
(5)番紅溶液：

番紅O(safranine O，又稱沙黃O)2.5g，95%乙醇100mL，溶解後可貯存於密閉的棕色瓶中，用時取20mL與80mL蒸餾水混勻即可。
以上染色液配合使用，可區分出革蘭氏染色陽性(G+ )或陰性(G- )細菌，前者藍紫色，後者淡紅色。
22.齊氏(Ziehl)石炭酸復紅液：

鹼性復紅0.3g溶於95%乙醇10mL中為A液；0.01%KOH溶液100mL為B液。混合A、B液即成。
23.姬姆薩(Giemsa)染液
(1)貯存液：

稱取姬姆薩粉0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。先將姬姆薩粉研細，再逐滴加入甘油，繼續研磨，最後加入甲醇，在56℃放置1-24h後即可使用。
(2)應用液(臨用時配製)：

取1mL貯存液加19mLpH7.4磷酸緩衝液即成。也可以貯存液∶甲醇=1∶4的比例配製成染色液。
24. 1%瑞氏(Wright's)染色液
稱取瑞氏染色粉6g，放研缽內磨細，不斷滴加甲醇(共600mL)並繼續研磨使溶解。經過濾後染液須貯存一年以上才可使用，保存時間愈久，則染色色澤愈佳。
二、常用試劑的配製
(一)顯微鏡鏡頭清潔劑
將乙醚和乙醇按7∶3混合，裝入滴瓶備用。用於擦拭顯微鏡鏡頭上油跡和汙垢等（注意瓶口必須塞緊，以免揮發）。
(二)固定液
1.福馬林-乙酸-酒精固定液（FAA，又稱萬能固定劑）
福馬林（38％甲醛）5ml＋冰乙酸5ml＋70％酒精90 ml，可用於固定植物的一般組織，但不適用於單細胞及絲狀藻類。幼嫩材料用50％酒精代替70％酒精，可防止材料收縮；還可加入5ml甘油（丙三醇）以防蒸發和材料變硬。FAA 可兼作保存劑。
2.福馬林-丙酸-酒精固定液（FPA）
福馬林5ml＋丙酸5ml＋70％酒精90ml，用於固定一般的植物材料，通常固定24h，效果比FAA 好，並可長期保存。
3.福馬林-丙酸-氯仿固定液（卡諾固定液）
配方一：無水酒精3份＋冰乙酸1份。
配方二：無水酒精6份＋冰乙酸1份＋氯仿3份。
是研究植物細胞分裂和染色的優良固定液，材料固定後，用95％和85％的酒精浸洗，清洗2-3次，也可轉入70％酒精中保存備用。
4.甘油-酒精軟化劑
甘油1份＋50％或70％酒精1份，適用於木材的軟化，將木質化根、莖等材料排除空氣後浸入軟化液中，時間至少一周或更長一些，也可將材料保存於其中備用。
5. 鉻酸-乙酸固定液
根據固定對象的不同，可分強、中、弱3種不同的配方：
弱液配方：10％鉻酸2.5 ml＋10％乙酸5.0 ml＋蒸餾水92.5ml。
中液配方：10％鉻酸7 ml+10％乙酸10 ml＋蒸餾水83 ml。
強液配方：10％鉻酸10 ml+10％乙酸30 ml＋蒸餾水60 m1。
弱液用於固定較柔嫩的材料，例如藻類、真菌類、苔藥植物和蕨類的原葉體等，固定時間較短，一般為數小時，最長可固定12-24 h，但藻類和蕨類的原葉體可縮短到幾分鐘到1h。

中液用作固定根尖、莖尖、小的子房和胚珠等，固定時間12-24 h或更長。
強液適用於木質的根、莖和堅韌的葉子、成熟的子房等。為了易於滲透，可在中液和強液中另加入2％的麥芽糖或尿素。固定時間12-24 h或更長。
(三)離析液
1. 鉻酸-硝酸離析液
鉻酸為三氧化鉻的水溶液：(1) 10 ml鉻酸；(2) 10 ml濃硝酸。
將上述兩液等量混合均勻後再使用。適於對導管、管胞、纖維等木質化的組織進行解離時使用。
2. 鹽酸-酒精固定離析液
將濃鹽酸、95％酒精等量混合備用，一般用於離析根尖細胞。
(四)解離液
常用於根尖等細胞的塗片，它能使細胞壁中層（果膠質）溶解，而使細胞分開。
1．鹽酸酒精
配方:95%酒精 1份，濃鹽酸1份。二者混合即成。
2．鹽酸溶液
（1）1 mol／L鹽酸
配方：濃鹽酸（比重1.19） 82.5ml
用蒸餾水定容 1 000ml
（2）0.2mol／L鹽酸
配方：濃鹽酸（比重1.19） 16.5ml
用蒸餾水定容 1 000m1
鹽酸水解時間對染色效果影響很大，水解時間短，易著色但較難壓片；水解時間長，染色慢而色淡；超過20min或水解溫度過高，往往染色極淡，或染不上色。各種材料最合適的時間有差別，一般來說，大染色體材料水解時間可較長，小染色體材料宜短。
改用0.2mol／L鹽酸於60℃恆溫下水解10～15min，對各種類型材料都能獲得細胞分離和染色合適的較好效果。
(五)預處理液
用於根尖壓片的前處理，能使細胞有絲分裂染色體縮短。
1．0.002mol/L 8-羥基奎林水溶液稱取0.29g 8-羥基奎林溶於1 000ml蒸餾水中。
2．對二氯代苯飽和水溶液將對二氯代苯加入蒸餾水中攪拌至不再溶解為止，即成飽和水溶液。
(六)各級酒精的配製
由於無水乙醇價格較高，故常用95％的酒精配製。配製方法很簡便，用95％的酒精加上一定量的蒸餾水即可。可按下列公式推算：
（原酒精濃度值（95％）－最終酒精濃度值）×100＝所需加水量
最終酒精濃度 95％酒精用量蒸餾水量
85％ 85ml 10ml
70％ 70ml 25ml
50％ 50ml 45ml
30％ 30ml 65ml
(七)其他試劑
1. 0.7%生理鹽水取NaCl 0.7g溶於100mL蒸餾水中。用於兩棲類動物。
2. 1%硝酸銀溶液稱取1克硝酸銀,溶於100毫升蒸餾水中即可。
3.碘酒
取碘2g和KI 1.5g，先加入少量的75%乙醇攪拌，待溶解後再用75%乙醇稀釋至100mL
4. 樹膠封固劑
將固體的加拿大樹膠塊，溶解於二甲苯或正丁醇中，濃度要適當（注意絕對不能混入水或酒精），是玻片標本好的封固劑。也可用人工合成的中性樹膠代替。
5. 明膠粘貼劑
明膠1-2 g＋石碳酸（苯酚）2g＋蒸餾水100ml＋甘油15ml。
配法：先將蒸餾水加溫至30-40℃，慢慢加入明膠，待全部溶解後，再加入2g苯酚和15ml甘油，攪拌至全溶為止，然後用紗布過濾，濾液貯於瓶中備用。
6.標本消毒劑
用於臘葉標本消毒，常用0.4％~1%升汞酒精溶液（95％酒精1 000ml+4 g升汞），浸泡標本0.5～2min。升汞有劇毒，不要弄到手上，消毒後注意洗手。