高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography/HPLC）又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術應用。
HPLC使用注意事項
1.流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45μm或更細的膜過濾)。
2.流動相過濾後要用超聲波脫氣，脫氣後應該恢復到室溫後使用。
3.不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液。
4.使用緩衝溶液時，做完樣品後應立即用去離子水衝洗管路及柱子一小時，然後用甲醇(或甲醇水溶液)衝洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對於柱塞杆外部，做完樣品後也必須用去離子水衝洗20mL以上。
5.長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相（如，甲醇等），因為純水易長黴。
6.每次做完樣品後應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。
7.C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。
8.堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查並清洗，清洗方法：
①以異丙醇作溶劑衝洗：
②放在異丙醇中間用超聲波清洗；
③用10%稀硝酸清洗；
9.氣泡會致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過程中要儘量避免產生氣泡。
10.如果進液管內不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相的清洗。
11.要注意柱子的pH值範圍，不得注射強酸強鹼的樣品，特別是鹼性樣品。
12.更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然後插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。
高效液相色譜常見故障的斷定
及解決診狀可能的原因解決方法
（一）保留時間變化
1.柱溫變化，柱恆溫，必要時需配置恆溫箱；
2.等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動相平衡柱；
3.緩衝液容量不夠用25mmol/L的緩衝液；
4.柱汙染每天衝洗柱；
5.柱內條件變化穩定進樣條件，調節流動相
6.柱快達到壽命，採用保護柱
(二) 保留時間縮短
1.流速增加，檢查泵，重新設定流速；
2.樣品超載，降低樣品量；
3.鍵合相流失，流動相pH值保持在3"7.5檢查柱的方向；
4.流動相組成變化，防止流動相蒸發或沉澱；
5.溫度增加，柱恆溫；
(三) 保留時間延長
1.流速下降管路洩漏，更換泵密封圈，排除泵內氣泡；
2.矽膠柱上活性點變化，用流動相改性劑，如，加三乙胺，或採用鹼至鈍化；
3.鍵合相流失，同前(二)3
4.流動相組成變化，同前(二)4
5.溫度降低，同前(二)5
（四）出現肩峰成分
出現肩峰成分：
1.樣品體積過大，用流動相配樣，總樣品體積小於第一峰的15%；
2.樣品溶劑過強，採用較弱的樣品溶劑；
3.柱塌陷或形成短路通道，更換色譜柱，採用較弱腐蝕性條件；
4.柱內燒結不鏽鋼失效，更換燒結不鏽鋼，加在線過濾器，過濾樣品；
5.進樣器損壞，更換進樣器轉子；
(五) 鬼峰
1.進樣閥殘餘峰，每次用後用強溶劑清洗閥，改進閥和樣品的清洗；
2.樣品中未知物，處理樣品；
3.柱未平衡，重新平衡柱，用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)；
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)每天新配，用抗氧化劑；
5.水汙染(反相) 通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水；
（六）基線噪聲
1.氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣，加柱後背壓
2.汙染(隨機噪聲) 清洗柱，淨化樣品，用HPLC級試劑
3.檢測器燈連續噪聲，更換氘燈
4.電幹擾(偶然噪聲)，採用穩壓電源,檢查幹擾的來源(如水浴等)
5.檢測器中有氣泡，流動相脫氣，加柱後背壓
(七) 峰拖尾
1.柱超載，降低樣品量，增加柱直徑採用較高容量的固定相
2.峰幹擾，清潔樣品，調整流動相
3.矽羥基作用，加三乙胺，用鹼致鈍化柱增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相pH值，鈍化樣品；
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死體積或柱外體積過大，連接點降至最低，對所有連接點作合適調整，儘可能採用細內徑的連接管；
7.柱效下降，用較低腐蝕條件，更換柱，採用保護柱；
(八) 峰展寬
1.進樣體積過大，同(四)1；
2.在進樣閥中造成峰擴展，進樣前後排出氣泡以降低擴散；
3.數據系統採樣速率太慢，設定速率應是每峰大於10點；
4.檢測器時間常數過大，設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%；
5.流動相粘度過高，增加柱溫，採用低粘度流動相；
6.檢測池體積過大，用小體積池,卸下熱交換器；
7.保留時間過長，等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫；
8.柱外體積過大，將連接管徑和連接管長度降至最小；
9.樣品過載，進小濃度小體積樣品；
液相色譜柱使用經驗談
色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，並將結果保存起來，作為今後評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由於所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。
1.樣品的前處理：
a.最好使用流動相溶解樣品。
b.使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
c.使用0.45祄的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2.流動相的配製：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流 動相具備以下的特點：
a.流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉澱在柱中(或長時間保留在柱中)。
b.流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
c.流動相的黏度要儘量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d.流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如，使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配製。
e.流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
f.在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利於檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3.流動相流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對於一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對於內徑為4.0mm柱，流速0.8mL/min為佳。當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可採用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間（如，使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.由於甲醇廉價，對於反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
b.對於正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純後的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大於18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。
c.含水流動相最好在實驗前配製，尤其是夏天使用緩衝溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。
d.流動相要求使用0.45 祄濾膜過濾，除去微粒雜質。
e.使用HPLC級溶劑配製流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
高效液相色譜儀操作步驟：
1)過濾流動相，根據需要選擇不同的濾膜。
2)對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10～20分鐘。
3)打開HPLC工作站（包括計算機軟體和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統。
4)進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先衝洗泵和進樣閥。衝洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。衝洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，衝洗時速度不要超過10mL/min。
6)調節流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。
7)設計走樣方法。點擊file，選取select users andmethods，可以選取現有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據需要而不同。
選完後，點擊protocol，一個完整的走樣方法需要包括：
a.進樣前的穩流，一般2～5分鐘；
b.基線歸零；
c.進樣閥的loading-inject轉換；
d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。
8)進樣和進樣後操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完後，點擊postrun，可記錄數據和做標記等。全部樣品走完後，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩餘物。
9)關機時，先關計算機，再關液相色譜。
10)填寫登記本，由負責人籤字。
注意事項：
1)流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣後的流動相要小心振動儘量不引起氣泡。
2)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
3)所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
4）壓力不能太大，最好不要超過2000psi
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