一、簡介
1.定義：薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）通常指以吸附劑為固定相的一種液相色譜法。即將固定相在玻璃、金屬或塑料等光潔的表面上均勻地鋪成薄層，試樣點在薄層的一端，流動相借毛細作用流經固定相,使被分離的物質展開。
2.原理：薄層色譜是吸附色譜，展開過程中，組分在兩相之間發生多次吸附-解吸附平衡，吸附牢的組分隨展開劑移動慢，吸附弱的組分隨展開劑移動快，一段時間後，組分被分離，各組分在薄層板上形成不同距離的斑點。
3.特點：
1）與紙層析和紙層析比較TLC快速、分離效率高、靈敏度高、顯色方法多樣、圖像易保存；
2）與液相色譜的比較
4.應用：薄層色譜是化學的一種分離和分析方法，可用於：
a.定性鑑別；
b.藥品的質量控制和雜質檢查；
c.化學反應進程的控制；
d.柱色譜分離條件的探索。
二、基本參數
1.比移值（Rf）=原點至組分點中心的距離/原點至流動前沿的距離。如圖：組分A的Rf=a/l；組分B的Rf=b/l。
2.相對比移值，即相對某一物質X的Rf值，用Rx表示。其定義為：Rx＝組分的Rf值／物質x的Rf值，組分A相對於物質B的「相對比移值」 RB =a/b
三、薄層色譜的操作
包括：吸附劑的選擇、薄層板的製作、展開劑的選擇、點樣、展開、定位於顯色、薄層層析的定量。
1.吸附劑的選擇：
常用的薄層層析吸附劑有矽膠、氧化鋁、纖維素、聚醯胺等。首先決定於樣品成分的性質，即它們的溶解性、酸鹼性、極性以及是否與吸附劑起化學反應等；其次要考慮吸附劑、載體是否容易得到及其價格等。
2.薄層板的製作：
層析板是用專門的塗布器把漿狀的吸附劑（紙漿、纖維素、矽膠、中性氧化物、聚醯胺、多孔性玻璃粉，矽烷化鍵合矽膠等）均勻地塗在在薄層板（玻璃板、金屬板或彈性塑料板）上，乾燥（110℃活化）後即可使用。
3.薄層層析中展開劑的選擇：
1）主要根據極性的不同來選擇流動相展開劑。各種展開劑按其極性不同排序為：烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<醯胺<醇類<酚類<羧酸
2）薄層條件的選擇，如圖是Stahl設計的用以選擇薄層條件的簡圖，（1）為被分離化合物的極性（2）為吸附劑的活度（3）為展開劑的極性。若將這三個因素各自固定在圓周的三分之一，轉動圓盤正中的三角形，如果角A指向極性物質，則角B指向活度小的吸附劑，角C就指向選用極性展開劑；如轉到A』，B』，C』處則又要作另外的選擇組合。
3）在具體工作中，展開劑的選擇還必須進一步通過實踐，一般可用下列三種方法：
(1)查閱文獻；
(2)微型薄層：用小玻片鋪上薄層，用各種經初步選擇認為可能應用的展開劑展開，從而選擇適當的展開劑，再用於一般的薄層層析。用微型薄層，節省材料和時間；
(3)微量圓環技術。
4)點樣
(1)樣品溶液一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發性有機溶劑，最好用與展開劑極性相似的溶劑溶解試樣，配成0.5%~1%的試液。
(2)點樣量：點樣量的多少與薄層的性能、厚薄及顯色劑的靈敏度有關。一般來說，樣品量最小為幾ng，常用量為幾至幾十µg，製備型的分離可以點樣到mg量。總之點樣量隨分離目的而定。
(3)點樣方式：最好是直徑3—5mm的圓點。常用點樣方式包括a.一般點樣，b.徑向點樣，c.條狀點樣，d.線形小孔點樣，e.樣品填入溝槽。
(4)點樣容器：定容毛細管、微量注射器、點樣器。
5）展開：
(1)展開操作a.展開槽的密閉，目的是使展開槽被展開劑蒸氣飽和並使展開劑組成不變。b.展開槽的飽和，為避免「邊緣效應」，在薄層板用展開劑蒸氣飽和有時是必要的。c.展開距離，常規薄層最長展距為20cm;高效薄層展距最長為10cm。
(2)水蒸氣的影響，在吸附薄層色譜的展開過程中，空氣的相對溼度以及展開槽中的水蒸氣必須嚴格控制，微量的水也能對色譜分離結果產生較大的影響。矽膠薄層板吸附水蒸氣的速度很快，0.25mm厚、20×20cm的薄層板在50%相對溼度中約3分鐘就失去活性的一半，而15分鐘時吸附的水分已達到最大值，因此，點樣速度的快慢，空氣相對溼度的大小，都可以影響分離以及重現性。適宜的相對溼度範圍也決定於溶質和溶劑的極性。
(3)溶劑蒸汽的影響：「邊緣效應」，Stahl在用氯仿-甲醇（95：5）為展開劑展開麥角生物鹼時發現，對同一種生物鹼，在薄層板中部的Rf值比在邊緣的Rf值小，稱此現象為「邊緣效應」（edge effect）。展開槽中被展開劑蒸氣飽和後再進行展開就可以消除。如圖所示，在未飽和展開草中薄層板上出現的邊緣效應
4.展開槽：常用的就是普通展開槽、雙底展開槽、水平展開槽。
5.展開方式：
1)近水平展開：將點樣後的薄層板下端浸入展開劑0.5cm，薄層上端墊高使薄層與水平成5-10º的角。
2)上行展開：將點樣後的薄層放在盛有展開劑的直立型的展開槽中，展開劑由薄層下端借毛細管作用上升至前沿。
3)下行展開
4)雙向展開
6.薄層層析的定性檢測：展開完畢後，把薄層從層析缸中取出，用鉛筆劃出或小針刺出展開劑前緣的位置，隨即進行顯色，以確定各個斑點的位置、Rf值和顯色情況，從而判斷試樣中含有哪些組分。有色物質經展開後呈現明顯的色斑，很易判斷。對於無色物質，可根據化合物的性質，用物理檢出法、化學檢出法、酶與生物檢出法和放射性檢出法進行顯色。
1）物理檢出法：紫外光、碘、水
2）化學檢出法：化學檢出法是在薄層上使用一種或數種化學試劑與被檢出物質反應，生成有顏色的化合物而定位。這種試劑叫顯色劑。顯色劑一般分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑
(1)通用顯色劑：a.濃硫酸或50%的硫酸溶液：極大多數有機物質，噴此種顯色劑後立刻或在加熱到110—120℃並經數分鐘後出現棕色到黑色斑點。b.酸鹼指示劑溶液：例如0.3%溴甲酚綠甲醇溶液，在綠色背景上顯現黃色斑，表示是脂肪族羧酸。常用的通用顯色劑還有：5%磷鉬酸乙醇、鹼性高錳酸鉀溶液、硝酸銀-氫氧化銨試劑、螢光顯色劑等。
(2)專屬性顯色劑，指能使某一類或少數幾類官能團或化合物顯色的試劑。例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液噴後在120℃加熱10分鐘，醛酮在黃橙色背景上顯紅色或橙色斑。
3）原位化學衍生化
4）生物與酶檢出法
5）放射顯影法
7.薄層層析的定量測定：
1）直接測定法：色譜分離後，直接用肉眼觀察比較或用儀器掃描斑點而測定其含量。
a.目測法樣品經色譜分離後，直接觀察所得斑點的大小和顏色的深淺，並與標準品在相同條件下展開所得到的一系列已知不同濃度的標準斑點相比較，而近似地判斷樣品中所測成分的含量。
b.測面積法展開後色譜上的斑點面積與化合物含量間，符合一定的線性關係。
c.儀器測定法：用光密度計或稱薄層掃描儀（TLC Scanner）掃描定量，該方法已成為薄層定量的主要方法。主要包括：吸收測定法，螢光測定法，螢光淬滅法。
2）洗脫測定法：
（1）斑點的定位
（2）斑點的洗脫:用吸集器將斑點位置的吸附吸下，然後用洗脫溶劑洗脫。
（3）測定：
a.紫外分光光度法：洗脫液調整至一定體積，在此化合物最大吸收波長處測定。同時把樣品斑點相應位置薄層吸附劑同樣取下做空白對照。
b.比色法：選擇靈敏度高、專屬性好的比色反應測定化合物含量，是比較常用的方法。
c.其它方法：極譜、庫侖滴定、螢光測定等。
四、特殊的薄層
1.高效薄層色譜（HPTLC）:是在普通薄層基礎上發展起來的一種更為靈敏、精細的薄層技術。高效薄層是採用小顆粒吸附劑製備的均勻薄層，分離效率比普通薄層提高三倍，檢出靈敏度增加，分析時間縮短。
2.棒狀薄層色譜（Rod-TLC）:將樣品點在薄層棒上，經點樣、展開後將被分離後的色譜棒通過適當的機械傳動裝置，水平地穿過檢測氫火焰的中心，使化合物燃燒裂解，形成離子碎片和自由電子，再由電極收集它們並產生與化合物量成正比的電流信號而測出各物質的含量
3.超薄層色譜（Ultra Thin-layerChromatography）:經四氯烷基矽（鍵合鉛）製成整塊矽膠板，而不用顆粒狀吸附劑。厚度10µm，有孔徑為1~2µm的大孔，孔徑為3~4nm的中孔。UTLC取代了玻璃板，不需要載體；展程1~3cm，縮短分析時間，節約展開劑；具有高分離效率和選擇性。可用於分離藥物、酚類、增塑劑、甾族化合物等