· 本文的通訊作者為香港大學的管軼教授，研究團隊通過分析在廣東、廣西被走私的穿山甲樣本發現，其身上的冠狀病毒與現在引發流行的新冠病毒高度相似，穿山甲可能是新冠病毒的中間宿主。
· 穿山甲身上的冠狀病毒屬於新型冠狀病毒相關冠狀病毒的兩個子譜系，迄今為止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠狀病毒相關冠狀病毒感染的哺乳動物。
在中國及其他地區，病毒性肺炎的持續爆發與一種新型冠狀病毒有關。該爆發目前可能與中國武漢的海鮮市場有關，那裡銷售的野生動物可能是人畜共患病的傳染源。儘管蝙蝠可能是新型冠狀病毒的儲存宿主，但尚不清楚任何有助於轉移給人類的中間宿主的身份。在這裡，我們報告了在中國南方的反走私行動中查獲的穿山甲（Manis javanica）中新型冠狀病毒相關冠狀病毒的鑑定。宏基因組測序確定了與穿山甲相關的冠狀病毒，它們屬於新型冠狀病毒相關冠狀病毒的兩個子譜系，其中一個在受體結合域上與新型冠狀病毒密切相關。穿山甲冠狀病毒的多個譜系及其與新型冠狀病毒的相似性的發現表明，穿山甲應被視為該新型人類病毒的可能中間宿主，應從海鮮市場中移除以防止人畜共患病傳播。
迄今為止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠狀病毒相關冠狀病毒感染的哺乳動物。令人驚訝的是，在穿山甲中發現了兩個相關的CoV譜系，並且它們都與新型冠狀病毒相關。這表明這些動物可能是這些病毒的長期宿主，這令人驚訝，因為穿山甲是數量相對較小的獨居動物，這也反映了它們的瀕危地位。但是，不能排除穿山甲獨立於蝙蝠或其他動物宿主而獲得了其新型冠狀病毒相關病毒。還值得注意的是，穿山甲冠狀病毒的兩個譜系均從馬來亞穿山甲中獲得，這些穿山甲可能自東南亞的被販運而來，並且我們對這種動物在其本土地區所維持的病毒多樣性的認識十分缺乏。毫無疑問，穿山甲人群中病毒傳播的程度尚需進一步調查，但在廣西和廣東省均發生新型冠狀病毒相關冠狀病毒感染的情況表明，該動物可能是冠狀病毒出現的潛在重要宿主。
冠狀病毒，包括與新型冠狀病毒相關的冠狀病毒，明顯存在於亞洲的許多野生哺乳動物中。儘管穿山甲中冠狀病毒的流行病學特徵、致病性、種間傳染性和可傳播性尚待研究，但此處提供的數據強烈表明處理這些動物需要相當謹慎，應嚴格禁止在溼貨市場中出售它們。為了了解它們在新型冠狀病毒出現中的作用以及未來人畜共患病傳播的風險，顯然需要對中國和東南亞自然環境中的穿山甲進行進一步監測。
【摘要】
在中國及其他地區，病毒性肺炎的持續爆發與一種新型冠狀病毒有關，該冠狀病毒被臨時稱為新型冠狀病毒。該爆發目前可能與中國武漢的海鮮市場有關，那裡銷售的野生動物可能是人畜共患病的傳染源。儘管蝙蝠可能是新型冠狀病毒的儲存宿主，但尚不清楚任何有助於轉移給人類的中間宿主的身份。在這裡，我們報告了在中國南方的反走私行動中查獲的穿山甲（Manis javanica）中新型冠狀病毒相關冠狀病毒的鑑定。宏基因組測序確定了與穿山甲相關的冠狀病毒，它們屬於新型冠狀病毒相關冠狀病毒的兩個子譜系，其中一個在受體結合域上與新型冠狀病毒密切相關。穿山甲冠狀病毒的多個譜系及其與新型冠狀病毒的相似性的發現表明，穿山甲應被視為該新型人類病毒的可能中間宿主，應從海鮮市場中移除以防止人畜共患病傳播。
【正文】
據報導，2019年12月30日在中國武漢爆發了嚴重的肺炎疾病。病原很快被鑑定為新型冠狀病毒——新型冠狀病毒。病例數迅速增加，從2019年12月的27起增加到2020年1月30日的7,818起，導致世界衛生組織宣布突發公共衛生事件。許多早期病例與湖北省武漢市的華南海鮮市場有關，據推測可能來自人畜共患病源。目前，中國疾病預防控制中心僅報告從市場上獲取的環境樣本呈新型冠狀病毒陽性。但是，由於2002-2003年的SARS疫情也有類似的溼貨市場，因此看來野生動物也可能參與了新型冠狀病毒的出現過程。確實，在爆發前，華南海鮮市場上有許多非水生哺乳動物可供購買。不幸的是，由於市場在疫情爆發後不久就被清理乾淨，因此從市場上確定野生動物中的源病毒具就有挑戰性。儘管現已鑑定出新型冠狀病毒與2013年從雲南中菊頭蝠蝙蝠中取樣的冠狀病毒密切相關，但尚未在其他野生動植物物種中檢測到緊密相關的病毒。在這裡，我們介紹了走私到中國南方的穿山甲中新型冠狀病毒相關病毒的鑑定。
我們調查了穿山甲（鱗甲目哺乳動物）的病毒組成。這些動物的重要性和利益日益增長，因為它們是所有種類哺乳動物中最不合法販運的動物：它們既被用作食物來源，其鱗甲也被用作傳統中藥。現在，在國際自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄中，許多穿山甲物種被視為極度瀕危。我們收到了2017年8月至2018年1月從18個馬來亞穿山甲（Manis javanica）收集的冷凍組織（肺，腸，血液）樣本。這些穿山甲是廣西海關在反走私行動中獲得的。令人驚訝的是，其RNA的高通量測序表明在43個樣品中的6個（2個肺，2個腸，1個肺-腸混合液，1個血液）中存在冠狀病毒。利用基因序列讀取數據，並通過擴增子測序填補空白，我們能夠獲得6個完整的或幾乎完整的基因組序列——分別表示為GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L，在系統發育分析中屬於新型冠狀病毒譜系（在乙型冠狀病毒屬內）。這些病毒也具有與新型冠狀病毒類似的基因組結構，具有9個預測的開放閱讀框架（圖1b；擴展數據表S5）。我們還能夠使用Vero E6細胞系成功分離出病毒（擴展數據圖S1）。
圖1
圖1.系統發育分析，描述了人類新型冠狀病毒，本研究中獲得的穿山甲冠狀病毒序列與其他參考冠狀病毒之間的進化關係。使用最大似然方法，使用GTR + I + G核苷酸取代模型和1,000個bootstrap重複序列來估計系統發育。 （A）從串聯的ORF1ab-S-E-M-N基因估計的Sarbecovirus亞種（β-冠狀病毒）的系統發育。紅色圓圈表示在這項研究中產生的穿山甲冠狀病毒序列。請注意，GD / P1L是從先前發布的原始數據重新組裝的共有序列。（B）冠狀病毒的基因組組織，包括穿山甲冠狀病毒，其預測的ORF以不同的顏色顯示。 （C）對新型冠狀病毒，穿山甲冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒RaTG13之間序列相似性變化模式的滑動窗口分析。查詢序列的名稱垂直顯示在分析框的右側。與不同參考序列的相似性由頂部圖例框中顯示的不同顏色指示。將廣東穿山甲冠狀病毒GD / P1L和GD / P2S合併進行此分析。頂部的藍色箭頭指示ORF在分析的比對中的位置。潛在的重組斷點以粉紅色虛線顯示，將基因組一起切成八個區域（省略了<200bp的區域；底部用紅線表示），用於系統發育分析。 （D）不同基因組區域的系統發育樹。 SARS-CoV和新型冠狀病毒相關譜系以藍色和紅色樹枝顯示。分支比例尺為0.1個替換/位點。
擴展數據圖S1
基於這些新的基因組序列，我們設計了用於qPCR檢測的引物，以確認原始樣品對冠狀病毒呈陽性。我們對2018年5月至7月之間收集的另一批穿山甲樣本進行了進一步的qPCR測試。在從12隻動物中獲得的19個樣本（9個腸道組織，10個肺組織）中，3個肺組織樣本呈冠狀病毒陽性。
除了來自廣西的動物外，在新型冠狀病毒爆發開始後，廣州海關技術中心重新檢查了他們先前在2019年3月反走私中獲得的5份已存檔的穿山甲樣本（2張皮膚拭子，1個未知組織，1個鱗甲）。在進行高通量測序後，發現該標本樣品含有冠狀病毒讀段，並且根據這些數據，我們能夠組裝一個21,505bp的部分基因組序列（表示為GD / P2S），約佔新型冠狀病毒基因組的72%。實際上，鱗甲上的這種病毒序列可能來自其他受感染穿山甲組織的汙染物。值得注意的是，2019年在廣東進行的另一個患病穿山甲的研究，也從肺部樣本中鑑定出與新型冠狀病毒類似相關的病毒基因重疊群。研究人員使用不同的組裝方法和手動審編，以生成部分基因組序列，該序列佔全長病毒基因組的約86.3％（在圖1a樹中表示為GD / P1L）。
這些新的穿山甲冠狀病毒基因組與新型冠狀病毒有大約85.5％至92.4％的相似性，並在系統樹中代表了新型冠狀病毒的兩個亞譜系，其中之一（GD / P1L和GDP2S）與新型冠狀病毒密切相關（圖1；紅色圓圈）。先前已經注意到，Sarbecovirus屬的成員經歷了廣泛的重組。為了支持這一點，在這裡進行的重組分析顯示蝙蝠冠狀病毒ZC45和ZCS21可能是重組體，包含來自多個SARS-CoV相關譜系（基因組區域2、5、7）和新型冠狀病毒相關譜系（包括穿山甲的譜系）的基因組片段（區域1、3、4、6、8）。
然而，更值得注意的是在穿山甲冠狀病毒、蝙蝠冠狀病毒RaTG13和人新型冠狀病毒之間觀察到了推測的重組信號（圖1c，d）。尤其是，新型冠狀病毒在受體結合域中與廣東穿山甲冠狀病毒表現出非常高的序列相似性（RBD；97.4％胺基酸相似性；圖1c和圖2a中的紅色箭頭表示），即使它在剩餘基因組與蝙蝠冠狀病毒RaTG13最為相似。蝙蝠冠狀病毒RaTG和人類新型冠狀病毒在RBD中的胺基酸相似度僅為89.2％。實際上，廣東穿山甲冠狀和新型冠狀病毒在RBD的五個關鍵殘基處具有相同的胺基酸，而RaTG13僅與新型冠狀病毒共享一個胺基酸（殘基442，人SARS-CoV編號9）。有趣的是，對RBD中僅同義位點的系統發育分析表明，廣東穿山甲的系統發育位置與剩餘病毒基因組的系統發育位置一致，而不是新型冠狀病毒的最接近親緣關係（圖2b）。因此，廣東穿山甲冠狀病毒和新型冠狀病毒的胺基酸相似性可能是由於選擇性介導的趨同進化而不是重組引起的，儘管很難在當前數據的這些情況之間進行選擇。儘管尚不清楚任何趨同進化的驅動因素，但其發生可能以及重組的發生可能，將進一步突顯中間動物宿主在人類病毒出現中所扮演的角色。
圖2
圖2.（A）序列比對顯示人，穿山甲和蝙蝠冠狀病毒中的受體結合域（RBD）。 根據Wan等，在SARS-CoV RBD和人ACE2蛋白之間結合的五個關鍵殘基用紅色框表示，而與ACE2接觸的殘基用黃色框表示。 注意，廣東穿山甲序列，編碼胺基酸337脯氨酸，420天冬氨酸，499脯氨酸和519天冬醯胺的密碼子位置具有歧義的核苷酸組成，可能分別導致蘇氨酸，甘氨酸，蘇氨酸和賴氨酸的替代胺基酸。 廣東：廣東，廣州：廣西。 （B）從整個RBD區域（上）和僅同義位點（下）估計的新型冠狀病毒相關譜系的系統樹。 顯示了從1,000個引導程序副本獲得的分支支持。
迄今為止，穿山甲是除蝙蝠以外唯一被新型冠狀病毒相關冠狀病毒感染的哺乳動物。令人驚訝的是，在穿山甲中發現了兩個相關的CoV譜系，並且它們都與新型冠狀病毒相關。這表明這些動物可能是這些病毒的長期宿主，這令人驚訝，因為穿山甲是數量相對較小的獨居動物，這也反映了它們的瀕危地位。但是，不能排除穿山甲獨立於蝙蝠或其他動物宿主而獲得了其新型冠狀病毒相關病毒。還值得注意的是，穿山甲冠狀病毒的兩個譜系均從馬來亞穿山甲中獲得，這些穿山甲可能自東南亞的被販運而來，並且我們對這種動物在其本土地區所維持的病毒多樣性的認識十分缺乏。毫無疑問，穿山甲人群中病毒傳播的程度尚需進一步調查，但在廣西和廣東省均發生新型冠狀病毒相關冠狀病毒感染的情況表明，該動物可能是冠狀病毒出現的潛在重要宿主。
冠狀病毒，包括與新型冠狀病毒相關的冠狀病毒，明顯存在於亞洲的許多野生哺乳動物中。儘管穿山甲中冠狀病毒的流行病學特徵、致病性、種間傳染性和可傳播性尚待研究，但此處提供的數據強烈表明處理這些動物需要相當謹慎，應嚴格禁止在溼貨市場中出售它們。為了了解它們在新型冠狀病毒出現中的作用以及未來人畜共患病傳播的風險，顯然需要對中國和東南亞自然環境中的穿山甲進行進一步監測。
【方法】
經倫理學批准（野生動物救治規定[2011] 85），廣西壯族自治區陸生野生生物救助和流行病監測中心對所研究的動物進行了救治。按照程序指南（穿山甲救援程序，2016年11月）收集樣品。
廣西穿山甲的樣品採集，病毒檢測和測序
我們在2017年8月至2018年1月間從中國廣西醫科大學收集了18株穿山甲（Manis javanica）的冷凍組織樣本。這些穿山甲被廣西海關在日常反走私行動中查獲。所有動物個體均包含來自包括肺，腸和血液在內的多個器官的樣品，除了6隻僅可獲得肺組織的個體，5隻僅具有腸和肺組織混合的個體，1隻僅具有腸組織的個體和1隻包含2個血樣的個體。 使用腸-肺混合樣本，我們能夠使用Vero-E6細胞系分離出新型的乙型冠狀病毒（擴展數據圖S1）。使用高純病毒RNA試劑盒（瑞士羅氏）對所有43個樣品進行RNA提取。對於RNA測序，使用Ion Total RNA-Seq Kit v2 （賽默飛世爾科技公司，MA，美國）構建測序文庫，然後使用Ion Torrent S5測序儀（賽默飛世爾科技）對文庫進行測序。使用SuperScript III第一鏈合成系統（賽默飛世爾科技，MA，美國）進行逆轉錄用於RT-PCR。使用NEBNext Ultra II DNA庫製備試劑盒構建DNA庫，並在MiSeq測序儀上測序。 NGS QC工具包V2.3.3用於刪除低質量和短讀的內容。利用NCBI / GenBank可獲得的數據，將BLASTn和BLASTx都用於搜索本地病毒資料庫。使用CLC Genomic Workbench v.9.0組裝基因組序列。為了填補高通量測序中的空白並獲得整個病毒基因組序列，設計了基於蝙蝠SARS樣冠狀病毒ZC45（GenBank登錄號MG772933）序列的擴增子引物，用於基於擴增子的測序。
總共6個樣本（包括病毒分離株）包含與乙型冠狀病毒匹配的讀數（擴展數據表S1）。我們從這些樣品中獲得了近完整的基因組（與新型冠狀病毒相比，達到98％），病毒基因組分別表示為GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L。基於這些基因組序列，我們設計了用於qPCR的引物，以確認原始組織樣品的陽性（擴展數據表S4）。除了6個帶有冠狀病毒讀數的原始樣本外，這還顯示了一個原始肺組織樣本，該樣本也是qPCR陽性的。我們進一步從廣西醫科大學的研究小組於2018年5月之間採樣的12種走私穿山甲中檢測了另外19個樣品（9個腸組織，10個肺組織）。 GX / P1E，GX / P2V，GX / P3B，GX / P4L，GX / P5E和GX / P5L的基因組序列已提交給GenBank和GISAID資料庫，其登錄號一經生成便可以使用。
擴展數據表S1
廣東穿山甲的樣品採集、病毒檢測和測序
在新型冠狀病毒爆發開始後，廣州海關技術中心重新檢查了他們在2019年3月進行的反走私行動中獲得的5份穿山甲樣品（2支皮膚拭子，2種未知組織，1個鱗甲）。自所有五個樣品提取RNA（美國，Qiagen），並由中國廣東省Vision Medicals在Illumina HiSeq平臺上進行了高通量RNA測序。使用BLAST方法發現量表樣本包含冠狀病毒讀數。這些讀物通過重新評估（MEGAHIT v1.1.312）和使用參考（BWA v0.7.1313）組裝方法（以BetaCoV / Wuhan / WIV04 / 2019為參考）進行了質量評估、清洗和組裝成重疊群。合併重疊群，並獲得約72％的冠狀病毒基因組（21,505bp）。該序列被稱為穿山甲冠狀病毒GD / P2S。
劉等人最近發表了一項穿山甲的宏轉錄組研究，並將21個RNA-seq原始文件保存在SRA資料庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）中。我們使用BLAST方法篩選了這些原始讀取文件，發現其中五個（SRR10168374，SRR10168376，SRR10168377，SRR10168378和SRR10168392）包含了映射到新型冠狀病毒的讀取。對這些讀數進行質量評估、清理，然後使用MEGAHIT12重新組裝，並使用BWA13作為參考組裝。然後將這些讀段合併並整理到堆積比對文件中，以獲得共有序列。該組合的共有序列長度為25,753bp（約佔BetaCoV /Wuhan/ WIV04 / 2019的86.3％），並表示為穿山甲CoV GD / P1L。值得注意的是，它與GD / P2S序列具有66.8％的重疊且僅0.21％的差異（即序列鑑定為99.79％）。由於它們的遺傳差異非常低，為了進行重組分析，我們將GD / P1L和GD / P2S序列合併為單個共有序列，以最大程度地減少任何序列中的缺口區域。廣西和廣東穿山甲冠狀病毒的病毒基因組構造與新型冠狀病毒相似。他們共有9個開放閱讀框（ORF），並且共享相同的ORF1ab複製酶，包膜糖蛋白峰（S），包膜（E），膜（M），核衣殼（N）和其他預測的ORF的基因順序。擴展表S5提供了ORF長度和與新型冠狀病毒和蝙蝠冠狀病毒RaTG13的相似性的詳細比較。
基因序列、系統發育和重組分析
於2020年1月17日從Virological.org（http://virological.org）和GISAID（https://www.gisaid.org）資料庫下載了人類新型冠狀病毒和蝙蝠RaTG13冠狀病毒基因組序列。由提交者共享（擴展數據表S2）。從GenBank（擴展數據表S3）下載了其他冠狀病毒（Sarbecovirus屬），並與此處獲得的進行了比較。我們使用MAFFT v7.27314構建了完整基因組和單個基因的多序列比對。使用PhyML v3.115估算了最大似然系統發育，並利用具有1,000個引導複製的核苷酸取代的GTR + I + G模型。為了研究潛在的重組事件，我們實施了窗口滑動方法來確定查詢序列和參考序列之間序列相似性和系統發生聚類的變化模式，以及直接從多序列比對中進行的系統發生聚類的掃描。如上所述，使用PhyML從每個窗口提取（即基因組區域1至8）中估計最大似然樹。
擴展數據表S2
擴展數據表S3
擴展數據表S4
擴展數據表S5
通訊作者：管軼，香港大學，等
發布日期：2020年2月18日
發布渠道：biorxiv
原文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.13.945485v1
原文標題：Identification of 2019-nCov related coronaviruses in Malayan pangolins in southern China
譯者：小西 | 網易公開課
作者：2020/02/18 管軼，香港大學，等