編者按：
近年來，鑑別和操縱各類神經元功能的腦研究技術在神經科學領域引發巨大的關注，許多科學家們利用Cre-loxP重組酶系統研究大腦正常工作的機理及各種腦疾病的起因。20世紀90年代初，還在做博士後研究的華人科學家錢卓開始探索Cre-loxP重組酶系統用於腦科學研究。當時，許多同行，包括他的導師都認為這將是一條死胡同。有趣的是，錢卓成功了。20年後，Cre-loxP重組酶系統介導的神經遺傳技術成為了腦科學領域的基本技術平臺之一，為基因在各腦區的特異性敲除、轉基因表達、腦彩虹影像、逆轉錄病毒神經網路示蹤、大腦透明技術、化學遺傳學和光遺傳學等提供基礎技術支撐。近期的研究還發現了一系列新的基因重組蛋白，它們能對聲納、磁信號或快速電壓變化產生反應，正在被用來開發聲納遺傳、磁遺傳學技術以及探測神經元放電變化的電壓成像技術。可以預見的是，Cre-lox神經遺傳學技術將繼續在腦研究中發揮作通用平臺的重要作用。
撰文 | 錢卓 （美國奧古斯塔大學喬治亞醫學院大腦與行為研究所所長、雲南西雙版納生物醫學研究院院長）
一百多年前，西班牙神經解剖學家、1906年諾貝爾獎得主Ramón y Cajal在顯微鏡下觀察到大腦不同神經元的微觀結構，驚嘆於各種腦神經細胞如同夜空閃爍的星星一樣美麗。近代神經科學的新篇章由此開啟[1]。
20世紀70、80年代，隨著單細胞標記和膜片鉗技術的出現，神經元結構與功能的研究得到了飛速的發展[3，4，5，7]。分子生物學技術也進一步把神經科學領域推到了更深層次的基因和蛋白質水平[8，9，10，11，12，13，14，15，16]，大大推動了突觸可塑性機理的研究[17，18]以及利用遺傳工程技術增強大腦學習記憶和認知功能的研究[19，20]。
20世紀80年代後期和90年代初，在Mario Capecchi， Oliver Smithies和Martin Evan三位先驅基因打靶和胚胎幹細胞技術（該工作使他們在2007年共享諾貝爾生理學或醫學獎）工作的基礎上[21]，幾個著名的實驗室開始嘗試創建突變小鼠用於基因在發育、腫瘤和免疫方面的功能研究[23，24，25]。隨後，Alcino Silva， Seth Grant和Thomas O』Dell利用基因的敲除技術來研究CaMKII或Fyn蛋白激酶在突觸和記憶功能 [26，27，28]。這些工作為基因和大腦功能的研究開闢了新的思路。然而，大家很快發現，許多全身基因打靶（基因在單個受精卵時就被敲除）構建的小鼠模型，由於遺傳補償缺少表型，或由於被敲除的基因在許多器官發育中的重要作用，發生了產後夭折或發育不良的情況。比如，在CaMKII基因敲除的小鼠身上，人們觀察到了自發性的癲癇症狀，而在Fyn基因敲除的小鼠中，大腦海馬中的齒狀回明顯存在神經發育缺陷。這兩種情況立即引起了關於如何解釋模式小鼠腦功能缺陷的激烈爭論：到底是先天發育缺陷，還是該基因在成年大腦思維過程中的調節作用，引起了小鼠的學習記憶功能下降？鑑於NMDA受體在可塑性中的關鍵作用，麻省理工學院的李育慶等人[29] 著手去證明其在學習行為上的開關作用，但是他們發現NMDAR1基因敲除的新生幼鼠由於大腦發育的缺陷（如吸吮反射的缺失），出生15小時後就全部死亡了。這些夭折的小鼠丘腦的固有觸鬚桶狀結構（stereotypic whisker barrels）沒有形成，說明了NMDA受體在腦結構發育中的關鍵作用[29]，對發育神經科學家來說，是一個令人興奮的發現。相反，這樣的結果對於認知和行為神經科學家來說，卻是令人失望的，他們無法利用全身基因敲除技術來研究成年大腦的思維活動與神經機理。大家渴望能有一種新的遺傳工程技術，不僅能避開發育過程，而且還能把任何一個基因只在特定的腦區的某一類細胞中進行條件性刪除。
年輕而喜歡冒險的歲月
我對研發新一代遺傳工程技術的興趣起源於1990-1993年在哥倫比亞大學的那段經歷。1990年，我從明尼蘇達大學博士畢業，來到Eric Kandel（2000年諾貝爾生理學或醫學獎得主）實驗室作博士後。密西根大學Bernie Agranoff教授曾在1964提出長時記憶需要新的蛋白質合成和基因表達。因為我看了一本描述Kandel在海兔研究中「爭鬥內幕」的科普書（Explorers of the Black Box： The Search for the cellular Basis of Memory），我在Kandel實驗室主動避免用海兔做研究，而是選擇大鼠為研究對象，尋找並克隆能被大腦活動所調節的基因。在我之前，Kandel兩個極為優秀的博士後（在其他實驗室讀博期間就已發過一兩篇Cell文章）由於技術原因，都徒勞而歸。1990到1993年，我利用蛋白抑制所引進的即早基因「超表達」的現象，首次成功地差異克隆了一批被大腦活動所調節的新基因，包括大腦特異的即早基因BAD1 （Brain Activity-Dependent）、組織型纖溶酶原激活劑（tPA）和一種促細胞分裂的原活化蛋白激酶磷酸酶[30，31]。後來， BAD1基因也被約翰霍普金斯大學的Paul Worley實驗室分離並另命名為Arc （Activity-regulated cDNA）[32]。對我來說，分離出大腦新的基因固然令人興奮，如何檢測這些基因在腦認知記憶中的功能更是一個巨大的挑戰。大家已經知道基於反義寡核苷酸的「knock-down」方法既不精確也不可靠，而全身基因敲除看似是個不錯的選擇，但也有如上所說的局限性。
後來，我偶然發現杜邦公司的Brian Sauer博士的一篇論文報導了Cre重組酶在哺乳動物培養細胞株中對環形質粒轉染時成功切除標記基因的現象[33]。該文在結語提出了一個很重要的問題：「不知Cre是否也能引起哺乳動物細胞染色體上內在基因的lox位點重組？」 這引發了我嘗試用它來開發腦區和細胞類型特異性的基因敲除和/或轉基因過表達新技術的念頭。我知道，所有的教科書和文獻描述DNA複製和重組與細胞分裂密切相關（如減數分裂或有絲分裂； 圖1）。這個基本的學說深深地印在每個人的腦中，從Sauer的論文開篇句不難看出，他也對此深信不疑：「近年來，有絲分裂期的哺乳動物的細胞DNA重組的控制過程已成研究的熱點……有絲分裂重組在免疫系統的發育和功能中起著核心作用。」 當時大家都知道大腦的神經元在出生後就不再進行有絲分裂（除了嗅球和海馬體中的齒狀回）。因此，任何人打算在成年大腦上進行DNA重組的工作，也意味著其科研生涯必將走入死胡同。大自然已經明確表明，所有的腦腫瘤都不是發生在神經元，而是在還能分裂的膠質細胞。因此，要想利用DNA重組的方式在大腦中進行區域和神經細胞特異性基因敲除顯然是不可行的。
►圖1
但我很想弄明白大腦基因的功能，只是當時只有少數的實驗室擁有用來製作傳統基因敲除小鼠的基因打靶設施和胚胎幹細胞。因此我放棄了申請大學Faculty（教職）的機會（那時大家一般只做一個博後），而聯繫了猶他州的Mario Capecchi和麻省理工學院的Susumu Tonegawa兩位大師，表達了想做第二個博後的願望。高興的是他們都同意了。於是，我去向Kandel尋求指導和建議，他建議我去Tonegawa的實驗室，這讓我有些詫異（Tonegawa因發現免疫抗體多樣性的遺傳機理在1987年諾貝爾生理學或醫學獎，然後轉行闖入了Kandel所在的學習記憶領域這一地盤，因此他倆關係很僵）。我也取得了Kandel實驗室另一博士後Mark Mayford的同意使用他克隆的CaMKII啟動子，該啟動子將在小鼠出生2到3周後激活並只在前腦的主要細胞如錐體細胞上表達[34]。對於Kandel的指點和Mayford的慷慨我萬分感動。直到數年後Mayford喝了酒後才偷偷地告訴我，原來Kandel當時看中了我的想法會註定失敗，正好來個一石二鳥，為消耗掉一個現在的和一個將來可能的競爭對手，「紳士般」地順水推了這一舟。
1993年秋天，我來到麻省理工學院。在我向Tonegawa做了只有15秒的簡短介紹後（大名人們都太忙了），免疫專家的他並沒有對我想研發的Cre-loxP神經遺傳技術有什麼看法，而是放任自由。我驚訝地發現這個有40個博後和學生的大實驗室瀰漫著叢林動物生存法則的氛圍。不過總的來說，麻省理工學院還是一個非常令人興奮的地方。
開發Cre-loxP神經遺傳技術，面臨著三大風險：
（1）當時的教科書中認為，DNA重組只能發生在分裂細胞中，而我的直覺是，皰疹病毒（引起唇皰疹）感染外周神經節並以某種方式進行自身複製（迄今為止，該機制仍然是未知的），而神經節的神經元「可能」沒有分裂；
（2）實驗的周期長而且程序複雜，兩年內沒有反饋，何況這是第二個博士後，哪怕在原理上能成立，如果在技術上出了差錯，我仍將求職困難。我必須構建一系列質粒並創建出至少三種不同的小鼠品系，然後著手開始多年的交叉繁殖工作（圖2A，B）。在那個年代，能夠得到一隻基因突變的小鼠，已屬非常難得。事實上，因為複雜的程序、冗長的項目周期和昂貴的成本，再加上得到的可能是沒有任何表型或非己想要的結果，學術界的一個殘酷現實就是只有少數幾個成功的人能得到一份大學的教授工作，另一大批沒有成果的、不幸的博士後們只能從學術界消失。
（3）我給自己挖的另一個坑是：我選擇NMDAR1而不是BAD1/Arc作為條件性敲除的基因。我們知道，如果在插入LoxP的位點在某種方式上幹擾了NMDA受體的表達，那麼數年後得到的將是生下就夭折的小鼠[29]。相反，如果在LoxP插入位點時，無意中把Arc基因弄壞，至少我還能發表一篇全身基因敲除的文章。但是我說服了自己，相信自己的想法不僅有希望，而且還能得到好結果：不成功，便成仁，到時，我也會因不相信教科書的教義，而得到一枚「榮譽傻瓜勳章」。
►圖2
真正開始實驗時，亟需把紛繁而又複雜的事項進行合理的安排。剛到新的實驗室，一切還沒理順，幸好身邊的幾個同事都很友好，都願意幫忙。David Gerber和Toshikuni Sasaoka分別教我受精卵和囊胚的微注射；陳東風在免疫抗體和染色方面給予指導；李育慶（現在佛羅裡達大學任教）分享他對NMDAR1質粒構建的見解；徐明（現在芝加哥大學任教）為我提供胚胎幹細胞並教我如何進行完美的胚胎幹細胞培養；同時我也非常感謝加州理工學院的David Anderson提供的LacZ報告基因和杜邦的Brian Saucer提供的Cre-loxP質粒。
1994年初，我完成了所有的質粒構建並開始轉基因小鼠的繁育和floxed NR1胚胎幹細胞打靶。更幸運的是，我還有一個勤奮的本科生Cindy Tom和技術員Jason Derwon協助進行基因分型和腦組織切片的工作。
7月，德國的Klaus Rajewsky在Science上報導了他們在T細胞的RNA聚合酶中取得了50%的敲降[35]，一團黑雲飄到了我的頭頂。因為這意味著，即使在分裂的T細胞中Cre重組的效率也不高：或是50%的T細胞可以100%敲除RNA聚合酶，或100%的細胞只刪除一個基因的拷貝，或更糟的是，兩種情況相互混合。儘管如此，我仍「奢望」（在進一步的文獻搜索後）他們使用的瞬時激活啟動子可能是T細胞發育過程中的Cre重組效率低下的罪魁禍首。在隨後的歲月裡，我把自己變成了鴕鳥，不顧外界的情況，一頭扎進了我的Cre-loxP神經技術研發的沙堆裡。
當年的深秋，我終於從實驗中第一次得到了反饋。
在一個陽光明媚但寒冷的早晨，我仍然記得在顯微鏡下，我看見 LacZ大腦染色切片時的那種無法言喻的驚喜，在第一條的 Cre 轉基因品系小鼠大腦中，我就發現海馬CA1區錐體細胞中發生了特異的基因重組 （圖 2）。因為海馬 CA1區 是許多可塑性和記憶研究者眼中的「宇宙中心」，這樣的好運使我堅信上帝不僅存在，而且一直就在我的身旁。隨後，另外的幾個 Cre品系也確認了類似 CA1區域特異性的重組；然後其他的Cre品系小鼠還顯示具有前腦的特異性。當Tonegawa從日本出差回來，我向他匯報了我的發現。可能由於他在倒時差的緣故，他也沒有想起我這幾年在做的是什麼課題。當他醒悟過來後，非常興奮，立即打電話給加州大學洛杉磯分校的Alcino Silva（把Tonegawa引入神經領域的第一個博後，已成為該校的助理教授），與對方分享了這一驚喜。
與此同時，我在思考為什麼本來應該在前腦表達而不是CA1區特異性的CaMKII 啟動子會有如此的特異性作用。陳東風和我通過對Cre的染色找到了原因——我們發現 Cre在CA1區錐體細胞上的表達更高，因此基因順利而有效地重組了。在之後的6到8個月的時間裡，我通過交雜Cre轉基因T29-1品系獲得了floxed NR1純合子小鼠，確認了CA1區錐體細胞特異性 NMDA 受體敲除。拿到3-5周的小鼠，Pato Huerta和我就各自推進腦片記錄和組織學實驗。我們亦留出一組小鼠與Tom McHugh， Kenny Blum和Matthew Wilson進行合作研究，在NR1突變小鼠上記錄海馬位置細胞的放電活動模式。現在，我們知道T29-1的Cre-lox重組在出生兩個月的小鼠上保留了CA1區特異性，不過隨著Cre表達時間的積累，如同預期的CaMKII啟動子的動態，大概在小鼠出生第8周後開始，特異性重組將逐步擴散之整個前腦。
1996年的秋天，我們準備給Cell雜誌投3篇連續的文章。我們決定將報告Cre-lox神經遺傳技術的可行性作為第一篇，CA1區特異性NMDA受體敲除研究作為第二篇，位置細胞的特性作為第三篇。因為在工作中使用了Kandel實驗室的CaMKII啟動子，最初和Eric Kandel商議的是，Cre-lox的工作萬一成功，我們將把他和Mark Mayford放在第一篇投稿中， 作為共同作者。這個起初不被看好的項目， 如今得到了出乎意料好的實驗結果，也因此帶來了諸多煩惱，令人頭痛。Kandel認為神經科學界對CA1特異性的NMDA受體敲除在學習和記憶研究具有更為重要而廣泛的意義，他要求將他的署名從第一篇的方法論文章中移到第二篇，但是Tonegawa也認為第二篇文章可能更重要，堅決反對。一個多月來來回回的爭吵讓我夾在中間左右為難，頭痛不堪，但也讓我親身體驗了什麼叫做腦袋被擠夾在石縫裡。最終Kandel的名字還是被Tonegawa硬放到了第一篇文章裡，而最終這三篇連續文章在沒有通訊作者的情況下，與1996年的12月底發表在了Cell雜誌上[36，37，38]（第一篇引用次數為921，第二篇為1526，第三篇514）。
神經科學的Cre-driver資源
Cre-lox神經遺傳技術可行性的成功驗證在神經科學領域引發了一個新的熱點。我也於1997年夏天在普林斯頓大學分子生物學系建立了自己的實驗室（施一公幾個月後也來到來該系，我們成為系裡僅有的兩位華人教授）。美國國立衛生研究院意識到Cre-lox神經遺傳技術對神經科學的獨特而重要的作用，啟動了神經科學研究藍圖Cre-driver （Cre-表達體系）項目，為認知行為學創建一批小鼠品系，以便更好地鑑定特定的細胞類型和神經迴路的功能。我也在立項、評審過程中提供了一些指南和建議（我迴避了申請，而專注創構轉基因「聰明鼠」， [39]）。美國國立衛生研究院最終遴選了三個中心，啟動了神經系統表達Cre重組酶的轉基因小鼠的創建及繁殖工作。三個研究中心分別由貝勒醫學院的Ronald Davis博士（現在佛羅裡達州Scripps研究所），冷泉港實驗室的Z. Joshua Huang博士（與Brandeis大學的Sacha Nelson一起）和Scripps研究所的Ulrich Mueller博士領導。這幾個項目創建了數百條Cre-driver的小鼠品系[40]。現在，這些品系的小鼠獲得的途徑有突變小鼠區域資源中心（MMRRC）或美國最大的動物供應商Jackson實驗室的Cre庫（見表1）。
美國國立衛生研究院的神經科學研究藍圖還資助了洛克菲勒大學的GENSAT項目。該項目由Nathaniel Heintz領導，創建BAC-Cre重組酶驅動的小鼠品系[41]。現今，已經創建了總計288個Cre品系。除了官方的努力，許多個人實驗室和科研院校也創建了多種Cre-drivers[42，43]。迄今為止，Jackson實驗室已經收集了600多個Cre品系的小鼠模型，提供給大家研究。
歐盟也跟隨美國國立衛生研究院的倡議推出以CREATE命名的Cre-driver項目（為等位基因突變小鼠條件表達的資源協調）（表1）。CREATE聯盟代表的大多數歐洲、國際小鼠資料庫持有人以及研究團體的核心，建立Cre-driver品系的一體化戰略，並應用在小鼠上建模來研究複雜的人類疾病。各國的研究人員可以通過聯繫EMMA （European Mouse Mutant Archive， Italy） 或者 MSR （International Mouse Strain Resource； Table 1）來獲得Cre的不同品系。另外，英國、加拿大和日本也啟功和資助了他們自己的Cre-driver項目（表1）。
►表1
腦研究的一個重要通用平臺
在過去的十年中，Cre重組基因技術應用最令人激動的一個方向是採用光刺激操縱神經元的光遺傳學[44，45]。研究人員通過在豐富的Cre品系小鼠上或Cre病毒表達光感應離子通道，刺激或抑制某類神經細胞的放電，使其成為耀眼的明星（這一系統被Karl Deisseroth簡稱為光遺傳學）。親眼看到光感應離子通道能充分地利用Cre重組基因技術的原理及這些Cre品系動物[46]，為神經科學界更多的同行服務，對我來說是個莫大的樂趣。
在神經科學方面，並非僅有表達光感應離子通道受益於Cre-LoxP神經遺傳技術這一平臺。Cre-LoxP神經遺傳技術在化學遺傳學中已顯現出強大作用，使得科學家能夠激活或抑制特定的神經元。例如，在化學–轉基因修飾過的蛋白上進行過表達，如蛋白激酶[47，48]或在特定的神經元或腦區設計藥物激活專門受體[49]。研究人員還可以通過Cre品系使用floxed白喉毒素片段A（DTA）來刪除（毒死）特定的細胞，然後觀察所產生的表型。
此外，Cre-lox遺傳技術也應用於逆行病毒對大腦各種神經元的示蹤，如史丹福大學駱利群教授等小組示蹤錐體細胞或多巴胺細胞[50，51]，或被用在透明大腦（Clarity）特異神經元環路的示蹤方法中。哈佛大學的Jeff Lichtman和Joshua Sanes還巧妙地利用Cre-loxP系統的獨特性質在單個神經元中，隨機表達不同比例的紅、綠、藍色的綠色螢光蛋白（GFP）的衍生物，這種技術被稱為「腦彩虹」[52]。這種技術使他們能夠以一種獨特的顏色標記每一個神經元，對神經科學連接組學領域來說，無疑是巨大的貢獻。
Cre-lox遺傳技術平臺也被用於電壓敏感的蛋白質來監測神經元的活動變化。基因編碼的鈣傳感器，如GCaMPs，使得許多實驗室通過對鈣的瞬態來推斷神經元活動的變化[53]。研究人員也在開發其他基因編碼的電壓敏感的螢光蛋白，以便可以離體或在體的方式來研究神經元的放電反應[54，2，6]。
去年，Stuart Ibsen和Sreekanth Chalasani報導了一個有趣的方法，採用低壓超聲刺激產生的微氣泡可以增強機械的形變，從而激活力傳導通道（TRP-4）促發神經元放電[22]。作者發現，通過在特定的神經元中過表達TRP-4，可以增強神經元對超聲刺激的敏感性。另外，科研人員還報導了另一種非侵入性的方法：磁遺傳學（magnetogenetics），可以通過磁刺激在體激活神經元。比如，神經元的激活是可由表達並刺激陽離子通道（TRPV4）與順磁性鐵蛋白的混合體來實現[55，56]。或外源磁受體鐵硫簇組裝蛋白1（Isca1）[57，58]。可以想像，隨著各種新蛋白功能的開發，腦科學家們可利用Cre-lox技術平臺，利用它們操縱特定的神經元，進一步了解大腦的工作原理。
回首過去的20年，研發Cre-lox神經遺傳技術曾被同行斷定為是一條死胡同，但憑著直覺和初生牛犢不怕虎的衝勁，我用頭撞穿了「南山」，幸運地闖出了一條生路。如今在神經科學領域，幾乎每周都會有科研人員利用Cre技術的學術成果報導。當學生們問起時，我會感慨地鼓勵大家：年輕時當個愣頭青，說不定就是上帝給你的一大寶器！
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