Science子刊:利用抗CRISPR蛋白顯著降低CRISPR-Cas9脫靶效應

2020-11-28 生物谷

圖片來自Fuguo Jiang/UC Berkeley.


2017年7月16日/

生物谷

BIOON/---CRISPR-Cas9基因編輯是基於

細菌

產生的保護自己免受病毒感染的策略開發出來的。

如今有研究證實病毒進化出的反制措施，即被稱作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能夠被用來改進作為一種

基因治療

工具的CRISPR-Cas9，從而降低可能導致不良副作用的脫靶基因編輯。

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校和加州大學舊金山分校的研究人員證實最近發現的抗CRISPR蛋白降低脫靶效應多達4倍，就像一種切斷開關那樣讓CRISPR-Cas9完成它的任務之後失去功能。相關研究結果發表在2017年7月12日的

Science Advances

期刊上，論文標題為「Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic」。論文通信作者為加州大學伯克利分校創新

基因組學

研究所研究員Jacob Corn博士和來自加州大學伯克利分校的作為CRISPR-Cas9基因編輯發明人之一的Jennifer A. Doudna。

在這項研究中，這些研究人員讓CRISPR-Cas9分子利用嚮導RNA（gRNA）發現、切割和替換導致鐮狀細胞疾病的血紅蛋白編碼基因突變體。他們證實一種被稱作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白將這種CRISPR-Cas9分子的脫靶效應降低4倍。它在做到這一點的同時不會顯著地降低想要的在靶基因編輯。

論文共同第一作者、加州大學伯克利分校Corn實驗室博士後研究員Jiyung Jenny Shin說，「由於存在脫靶基因編輯，意料之外的突變就能夠產生，但是我們的論文像很多其他的論文一樣證實能夠對脫靶效應加以調整，而且這一點並不像人們可能所認為的那樣如此嚴重。」

在針對人細胞體外培養物開展的實驗中，Shin發現運送CRISPR-Cas9，隨後在幾小時後運送這種抗CRISPR蛋白是最為有效的方法來降低脫靶效應。這種蛋白模擬DNA的作用，將切割雙鏈DNA的Cas9據為已用，從而阻止切割進一步發生。

Shin說，「相比於在靶效應，抗CRISPR蛋白即便在有效的CRISPR作用6個小時之後加入也會降低脫靶效應2倍以上。在治療上，可能先用CRISPR治療一名患者，隨後利用抗CRISPR蛋白治療這名患者，就可降低脫靶效應。」

論文共同作者、之前發現了AcrIIA4的美國加州大學舊金山分校研究員Joseph Bondy-Denomy預計這些抗CRISPR蛋白會變成CRISPR基因療法的一個標準部分。Bondy-Denomy說，「比如，這種Cas9抑制劑（即AcrIIA4）能夠與Cas9編碼在相同的DNA片段中，在基因編輯完成之後，準確地定時關閉Cas9產生，而不會讓Cas9在細胞中停留而冒險產生脫靶效應。」

抗CRISPR蛋白結合

這些研究人員確定了這種抗CRISPR蛋白如何結合CRISPR-Cas9複合體。利用冷凍電鏡技術，他們發現這種抗CRISPR蛋白在本質上模擬DNA的作用，誘使CRISPR-Cas9與它結合，隨後從不釋放。

這種CRISPR抑制劑靶向Cas9蛋白表面上的一個位點，這個位點對Cas9的功能是至關重要的，因此當Cas9被這種抗CRISPR蛋白結合時，它不能夠切割DNA。

去年，Bondy-Denomy已報導攻擊性病毒用來讓在單核細胞增多性李斯特菌（

Listeria monocytogenes

）中發現的Cas9蛋白版本失活的4種抗CRISPR蛋白。它們中的兩種抗CRISPR蛋白也抑制科學家們最為常見使用的Cas9蛋白，該蛋白源自釀膿鏈球菌（

Streptococcus pyogenes

），因而也被稱作SpyCas9。另一個研究團隊已發現3種其他的抗CRISPR蛋白抵抗一種不同的但有前景的Cas9蛋白，該蛋白源自腦膜炎雙球菌（

Neisseria meningitidis

）。

當前的這項研究探究了來自李斯特菌的4種抗CRISPR蛋白之一的AcrIIA4對裝載著一種引導結合和切割互補DNA的gRNA的SpyCas9蛋白的影響。

加州大學伯克利分校和其他地方的研究提示著CRISPR-Cas9持續地欺騙細胞的DNA修復系統：CRISPR-Cas9切割它的靶位點，細胞修復這種DNA，CRISPR-Cas9再次切割，重複這種惡性循環直到DNA中出現突變，這種突變阻止Cas9結合，也正是在這個突變位點上，CRISPR-Cas9繼續向前移動以便發現另一個結合位點。

如今，當前的這項來自Corn實驗室和Doudna實驗室的研究提示著在Cas9成功地對靶基因進行編輯之後，添加一種抗CRISPR蛋白將會阻止基因組中的其他位點遭受不必要的損傷。

Corn說，「關閉Cas9基因編輯的能力與開啟它的能力同樣重要。想像一下，如果你有一把沒有關閉開關的電動剃刀！就最終的治療應用而言，能夠精確地控制在何時和在何處進行基因編輯是至關重要的。這些抗CRISPR蛋白為完全關閉Cas9和微調它的活性提供機會。」

Bondy-Denomy說，「Shin的數據提示著存在一種理想的讓Cas9在一段時間之內完成它的任務隨後將它關閉的時間窗口。我們實際上能夠利用這些抗CRISPR蛋白作為工具找出這種時間窗口，也就是對任何一種細胞類型和任何一種gRNA而言，我們想要Cas9在細胞中多長時間保持活性。」（生物谷 Bioon.com）

參考資料：Jiyung Shin, Fuguo Jiang, Jun-Jie Liu et al. Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic. Science Advances, 12 Jul 2017, 3(7):e1701620, doi:10.1126/sciadv.1701620

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