自新型冠狀病毒引起的疫情暴發以來，科學家們一直在努力尋找有效的病毒抑制劑。當地時間3月20日，頂級學術期刊《科學》在線發表了一篇題為「Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors」的研究報告，科學家們用X射線以1.75埃解析度解析了新冠病毒Mpro的晶體結構。新冠病毒中的主要蛋白酶（Mpro，又稱為3CLpro）是一個重要的潛在藥物靶標，對抑制病毒的複製至關重要。
此外，該研究探討了一種α-酮醯胺抑制劑的作用。通過優化結構，研究人員將先導化合物開發成為SARS-CoV-2 Mpro的有效抑制劑。
優化抑制劑的藥代動力學特徵顯示出明顯的肺向性，並且適用於通過吸入途徑給藥
。
由於尚無具有類似裂解特異性的人蛋白酶，該抑制劑不太可能具有毒性。在新冠病毒仍在全球肆虐的當下，該研究有利於推動相關抑制劑的設計，促進治療方法的形成。
該文章的作者主要由德國科研團隊組成，包括德國呂貝克大學、德國漢諾瓦醫學院、柏林大學附屬夏裡特醫院、馬爾堡大學、赫爾姆霍茲感染研究中心、中國長春吉大天元化學技術股份有限公司等，通訊作者為德國呂貝克大學生物化學研究所Rolf Hilgenfeld。
結構生物學家Rolf Hilgenfeld團隊自2002-2003年嚴重急性呼吸系統症候群（SARS）暴發以來，就一直在嘗試開發治療冠狀病毒的方法。當前，Hilgenfeld希望對新型冠狀病毒感染的動物進行兩種抑制劑化合物的測試，以期儘快開發出針對未來冠狀病毒暴發的治療方法。
新冠病毒是一種單鏈RNA正鏈包膜乙型冠狀病毒。與引起SARS（嚴重急性呼吸系統綜合症）和MERS（中東呼吸系統綜合症）的另兩種冠狀病毒類似，它的基因組編碼為非結構蛋白、結構蛋白和輔助蛋白。
非結構蛋白包括3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶（3-chymotrypsin-like protease，3CLpro）、木瓜蛋白酶樣蛋白酶（papain-like protease）、解旋酶（helicase）、和RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。結構蛋白則包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein）。
冠狀病毒中最具特徵的藥物靶標之一是上述的3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶，即主要蛋白酶（Mpro，也稱為3CLpro）。與木瓜蛋白酶一樣，這種酶在大型多蛋白1ab上的不少於11個切割位點上運行，對於加工從病毒RNA翻譯的多蛋白是必不可少的，因此，抑制這種酶的活性將阻止病毒複製。
此前，研究人員已經設計併合成了擬肽α-酮醯胺，作為β冠狀病毒和α冠狀病毒的主要蛋白酶以及腸病毒的3CLpro的廣譜抑制劑。
幾種α-酮醯胺抑制劑的化學結構，11r為綠色圓圈，13a為紅色圓圈，13b為藍色圓圈
上述抑制劑化合物對MERS-CoV中東呼吸系統症候群冠狀病毒、SARS-CoV（嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒）和腸道病毒均具有抗病毒作用，但其活性似乎在很大程度上取決於實驗中使用的細胞類型。
為了優化它以延長化合物在血漿中的半衰期，研究人員將P3-P2醯胺鍵隱藏在吡啶酮環中，修飾了現有的化合物11r（上圖中綠色圓圈），以期這能夠阻止細胞蛋白酶接近該鍵並使其裂解。
此外，為增加化合物在血漿中的溶解度並減少其與血漿蛋白的結合阻力，研究人員用疏水性稍差的Boc基團代替了疏水的肉桂醯基部分，得到13a這種化合物（上圖中的紅色圓圈）。
為了檢查13a中引入的吡啶酮環是否與靶標的三維結構兼容，研究人員確定了SARS-CoV-2主要蛋白酶的晶體結構（解析度為1.75）。
兩種不同視圖下SARS-CoV-2 主要蛋白酶的三維結構
研究人員發現，新冠病毒主要蛋白酶的三維結構與SARS-CoV主要蛋白酶的三維結構高度相似，序列同一性達96％。
其中，胰凝乳蛋白酶和小核糖核酸病毒3C蛋白酶樣結構域I和II形成六鏈反平行β桶，在它們之間帶有底物結合位點。結構域III是五個螺旋的球形簇，主要通過2個前體間鹽橋相互作用參與調節Mpro的二聚化。
SARS-CoV-2的Mpro形成的緊密二聚體具有一個接觸界面，主要位於分子A的結構域II與分子B的NH2末端殘之間。
研究人員使用蛋白酶的晶體結構來對接α-酮醯胺抑制劑13a。他們發現，與11r相比，13a在小鼠中的血漿半衰期增加了約3倍（從0.3小時到1.0小時），體外動力學血漿溶解度提高了約19倍，同時熱動力學溶解度提高了約13倍。但是，與11r相比，結構的調整導致其對SARS-CoV-2主要蛋白酶和腸病毒3C蛋白酶的抑制活性有所減少。
事實上，包括新冠病毒在內的β冠狀病毒Mpro的S2口袋具有顯著的可塑性，使其能夠「狡猾」地適應較小抑制劑的形狀。因此為了增強針對進化枝b的β冠狀病毒的抗病毒活性，
研究人員犧牲了抑制劑廣譜活性的目標，用較小的環丙基取代了13a的P2環己基部分，得到化合物13b
（本文圖1中的藍色圓圈）。
α-酮醯胺13b與SARS-CoV-2的Mpro的複合物X射線晶體結構，兩種解析度分別為1.95和2.20
研究人員使用20 mg / kg的劑量對小鼠進行皮下途徑的藥代動力學研究發現，化合物13a在小鼠血漿中的平均停留時間為約1.6小時，停留時間最多為約4小時，通過尿液排出的時間最多為24小時。血管外給藥後藥物在血漿中的最高濃度值（峰濃度，Cmax）為334.5ng/mL。
儘管13a從血漿中消失的速度非常快，但24小時後它在肺中的濃度為135ng/g，在小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的濃度為52.7ng/mL，這表明它已經被組織吸收。
接下來，研究人員對13b的有效性進行了測試，他們發現，13b與人血漿蛋白的結合度達到90％。
同樣對小鼠進行皮下注射時，研究人員用了更少的劑量（3 mg/kg），發現13b的Cmax為126.2 ng / mL，這大約是13a的峰濃度值的37％，但所用的化合物劑量大約降低了7倍。
同時，
13b在血漿中的平均停留時間延長至2.7小時，半衰期約為1.8小時。與13a相比，13b在血漿中的清除速度較慢
。
研究人員發現，4小時後，13b在小鼠肺組織中濃度仍達到約13ng/g。由於新冠病毒疾病對肺部有較大影響，13a和13b體現出的這種肺向性是有益的。
除皮下給藥外，研究人員還使用吸入裝置以3mg/kg對小鼠進行了霧化13b給藥。 24小時後，小鼠肺組織中存在13b的濃度為33ng/g。
小鼠對於抑制劑的吸入耐受良好，未顯示任何不良反應，研究者們認為這表明將該化合物直接施用於肺部是可能的
。
作者們最後寫道，鑑於這些有利的藥代動力學結果，此次研究為含吡啶酮的抗冠狀病毒藥物研發提供了有用的框架。
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