2018年9月,使用MALDI-TOF,通過檢測動物種類特異性多肽的動物毛髮鑑定法作為國際標準(ISO)在日本發行。另外,它還將被確定為日本工業標準(JIS)。即使僅用1根毛髮,也可採用該鑑別法進行分析。因此不僅可以防止山羊絨的假冒,還可以用於進行羽毛、人的頭髮等各種毛髮的鑑別以及食品混入異物檢查。該方法由金澤工業大學基因組生物工學研究所基於島津MALDI-TOF系統開發。
動物毛髮鑑別分析技術在各個領域都起著重要作用。動物毛髮被用於製作外套、上衣、毛衣等各種纖維製品。製作這樣的纖維製品時,有義務根據家庭用品品質標識法對纖維的種類、使用多種纖維時的混用率進行標識。另外,毛髮混入食品中時,確定毛髮種類對明確混入途徑至關重要。
除去水分,90%左右的毛髮由蛋白質組成。圖1顯示的是動物毛髮的構造。
毛髮在防止外部衝擊的同時,還起到了保溫的作用,這一功能和毛髮的構造有著密切的關係。毛髮的蛋白質中含有大量的類固醇,通過類固醇結合,在分子間形成了多個交聯結構。毛髮的化學分析需要進行溶解,使用名為還原劑的物質來切斷二硫鍵。另外,所得到的蛋白質提取液中含有多種蛋白質和鹽類等物質,因此,需要通過聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等進行純化。動物毛髮纖維MALDI-TOF鑑定流程如圖2所示:
經過胰蛋白酶處理的多肽MALDI-TOF MS分析,用MALDI-TOF MS檢測金屬靶板上的結晶樣品。調整雷射功率等的檢測條件,確保在觀察動物種類特異性峰值的m/z2450-2750領域能得到良好的解析度。
通過對SDS-PAGE蛋白條帶進行胰蛋白酶解後的樣品,進行MALDI-TOF MS檢測。找到不同動物種類的特異性峰值代表。
(a) Band1 KeratinⅡ (b) Band2 KeratinⅠ
通過MALDI-TOF MS技術找到山羊絨、羊毛、犛牛毛三者之間的差異峰值區間m/z 2450-2750和特異峰值。如圖4所示。
圖 4 MALDI-TOF MS 中的動物物種類特異性峰值
對這些動物種類特異性峰值進行MS/MS分析,推測胺基酸排列的結果如表1所示2)。由23個胺基酸組成的肽,山羊絨和羊毛之間有1個,山羊絨和犛牛毛之間有4個胺基酸不同。
很多纖維製品在加工工序中會進行漂白、脫色、染色等化學處理,但動物毛髮特殊的峰值位置不會因為這些處理而改變,因此明確其可用於識別纖維製品中的動物毛髮種類。
分析纖維製品中的動物毛髮時,為了避免產品成分出現偏差,最好對產品進行大範圍採樣並進行平均化,然後使用其中的一部分。因此,很少需要微量分析。另一方面,在分析食品中混入的毛髮時,建議儘可能採用少量試樣進行分析。
在科學調查中,通過毛髮的DNA分析可以得到很多與血型等能夠確定個人特徵相關的信息。但是,纖維製品中所使用的動物毛髮大多只有毛幹部分,特別是被濃重染色的產品,很難進行DNA分析。採用MALDI-TOF MS法分析蛋白質,即使是1根毛髮也可以充分進行檢測。
根據動物種類的不同,特異性的峰值位置也各不相同,但是同一屬性的動物在同一個位置出現峰值的情況比較多。山羊絨和安哥拉山羊毛等需要用顯微鏡識別。表2表示主要動物特異性峰值的峰值位置(m/z)以及從資料庫推定的胺基酸排列。狸貓、狐狸、狗的主峰位置是一樣的,但可以看到狐狸的第二峰值是2638,狗是2641,由此能夠對它們做出判斷。除了此處所示的動物以外,能夠利用基因組資料庫的動物也可推測並確認特異性峰值的位置。這樣,只看m/z2450-2750的光譜就可確定所含動物毛髮的種類,這就是MALDI-TOF MS法的一大特徵。
圖 6 1根毛髮MALDI-TOF MS 分析所得到的動物種類特異的峰值
表 2 各種動物毛髮特異的肽的胺基酸排列和峰值位置(m/z )
*1 根據NCBI 資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)推定
參考資料:
島津應用新聞No。65及文獻
1)大箸信一、出村由香、佐野元昭、SEN』I GAKKAISHI、68(10)、276 (2012).
2)大箸信一、出村由香、佐野元昭、吉岡陽一郎、SEN』I GAKKAISHI,70 (6)、114 (2014).
3)ISO20418-2 Textiles ̶ Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres ̶ Part 2: Peptide detection using MALDI-TOF MS.