一、樣本前處理及應用
目前臨床常見的大多數革蘭陰性菌都可以在固體瓊脂培養基上生長，然後選擇一個單獨的菌落，直接塗在MALDI靶上作為薄膜進行鑑定。而革蘭陽性細菌、奴卡菌、分枝桿菌和大多數的酵母樣真菌等，使用直塗靶板不能有效破壞其細胞壁，通常需要多步提取方法來保證質量，主要原因和獲得譜圖與資料庫的質量以及技術的局限性有關。對某些臨床急診病例，可以直接從生物樣本中直接進行病原體的鑑定，但許多類型的體液可能需要純化或分離後進行鑑定。
二、MALDI-TOF MS在細菌鑑定中的應用
1. MALDI-TOF MS對血培養陽性瓶直接鑑定細菌的應用：MALDI-TOF MS可直接用於血培養（Blood Cultures，BD）的細菌分離物的鑑定[8]，有研究對584個陽性BCs進行了測試，結果發現562個BCs中含有獨特的細菌種類[9]。然而，當BC中存在混合菌種時，MALDI-TOF MS只能識別出一種細菌，有可能出現誤識，並且其無法識別綠藻鏈球菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌等。直接分析肉湯血培養時，人體血液成分會產生幹擾或噪聲光譜。因此，預處理對減少幹擾、濃縮細菌具有重要意義。對於革蘭陽性菌或腸桿菌類似的生長較快的微生物，在綿羊血瓊脂培養基接種後，孵育2-3小時得到的薄菌落層即可在1分鐘內進行鑑定，這種方法稱為全細胞質譜（Whole Intactcell MS，WCMS），是一種通過MALDI-TOF MS獲取微生物蛋白譜數據的方法。單個細菌或酵母菌落中的微生物作為薄膜直接塗在MALDI靶板上。然後將1µl的HCCA基質溶液（50%的乙腈和2.5%的三氟乙酸配製在超純水中）滴在塗片上，可以用於大多數細菌蛋白的提取，用於MALDI-TOF MS分析。而有些細菌被多糖或包膜層包裹，例如分枝桿菌和某些酵母菌，很難使用基質溶液獲得其內部蛋白質，建議採用乙醇-甲酸（FA）萃取法對這些樣品進行高質量的光譜分析，將細菌在300µl純水中重懸，與900µl純乙醇混合，用渦流井在數秒內滅活微生物。高速離心2分鐘，仔細去除上清液。加入20-50ul70% FA混勻，再加入等量的純乙腈，渦旋混勻數秒。高速離心2分鐘形成細菌顆粒，將1µl上清液塗抹在MALDI靶上。待風乾後，用1µlHCCA基質溶液覆蓋樣品進行檢測，這樣能夠使酵母的鑑定效率得到很大提高[10]。對於有些微生物生長較為緩慢甚至需要48小時以上的厭氧培養，MALDI-TOF MS可以直接對去除蛋白和培養基等的陽性血瓶進行檢測，從而縮短病原體的鑑定時間。
2. MALDI-TOF MS在其他細菌陽性液體樣本中的應用：除陽性的血液培養外，臨床仍有些其他液體樣本需要進行微生物的鑑定，MALDI-TOF MS在大腸桿菌鑑定中的靈敏度為104-105 CFU[11, 12]。但是，該方法的靈敏度主要取決於樣本的類型，例如尿液樣本可以直接用於細菌鑑定，尿液樣本經流式細胞儀檢測確認細菌的存在後，取陽性尿液樣本4ml，2000g離心30s，去除白細胞和上皮細胞後使用15500g離心5min，收集細菌，使用FA提取細菌蛋白進行MALDI-TOF MS鑑定[12]。有文獻報導使用MALDI-TOF MS快速鑑定細菌性腦膜炎患者腦脊液（CSF）中的病原體，並且使用500ul腦脊液即可進行微生物學診斷，在CSF中加入100µl 13%的SDS，渦旋10s後13000g離心2min，沉澱使用1µl純水重懸，13000g離心，使用FA提取細菌蛋白後使用MALDI-TOF MS進行鑑定[13-15]。
三、MALDI-TOF MS在分枝桿菌鑑定中的應用
近幾十年來，得到確認的分枝桿菌已超過190個，致病性結核分枝桿菌複合體（MTC）導致結核病（TB）引起的公共衛生問題遍布全球，2016年有10,400,000人感染結核病，1,700,000人死於結核病。許多非結核分枝桿菌（NTM）也是公認的病原體，免疫功能低下的人更容易感染[16]。由於結核分枝桿菌生長緩慢，不同的菌種使用常規生化鑑定耗時較長，菌落形成後生化反應完全需要7-21天不等，而MALDI-TOF MS比傳統方法更加快速、準確和經濟，一般在菌落形成後僅需數小時的樣本製備就能得到相同的結果，能夠提高分枝桿菌的鑑定水平。與此同時，分枝桿菌的滅活是樣本處理的關鍵問題之一，Bruker質譜儀系統使用95℃加熱30min的滅活方法，而bioMe rieux質譜儀系統使用矽珠在70%乙醇中以3000 rpm/min的速度渦旋10-15min的方法進行滅活。矽珠在純乙腈渦旋1min或在70%乙醇中渦旋10-15min。在渦流造成的機械破壞後，樣本依次用等量的70% FA和純乙腈處理。將1µl提取物滴在MALDI靶板上，乾燥後用1µl HCCA基質覆蓋即可使用MALDI-TOF MS進行鑑定[17]。對於譜圖數較少的一些NTM容易造成資料庫的不可靠，仍需進一步研究補充[18]。近年來開發的一種新的用於表型藥敏的MALDI-TOF MS分析法-MALDI Biotyper藥敏試驗快速測定法（MBT-ASTRA）可用於NTM物種和結核分枝桿菌複合體成員的分析[19]。
四、MALDI-TOF MS在真菌鑑定中的應用
1. MALDI-TOF MS在絲狀真菌鑑定中的應用：Becker等人使用MALDI-TOF MS正確識別了95.4%的絲狀真菌分離菌[20]，Gautier等人對麴黴菌病、鐮刀菌病和毛黴菌病患者身上分離的菌株進行了鑑定，建立了2832個參考譜圖，可應用於347種黴菌，提高了黴菌的鑑定能力。並且從1107株（98.9%）臨床黴菌分離物中鑑定出1094株，對應107個不同種，甚至優於形態學鑑定（78.2%）[19]。絲狀真菌有多種培養和提取方法，如肉湯培養法和慶大黴素氯黴素瓊脂板培養法都廣泛應用於微生物實驗室，通常在27℃下培養72h，收集部分菌絲並使用FA提取，向樣本中加入300µl純水和900µl乙醇，充分混勻後使用13000g離心10min，取上清，風乾1h。乾燥後的樣本使用20-50µl70% FA孵育5min，加入等量的乙腈孵育10min，將樣本點在MALDI板子上進行鑑定。對於絲狀真菌的鑑定，MALDI-TOF MS似乎比生物化學技術更加準確，且更容易、更快、更便宜，並且可用於近源物種的鑑定。
2. MALDI-TOF MS在念珠菌鑑定中的應用：近幾年來，免疫抑制劑的使用和腫瘤患者放化療造成免疫損傷使得真菌感染呈持續上升趨勢，其中白色念珠菌感染是血源性真菌感染的主要病原體[21]，每年全球約有7,280萬患者因酵母菌致病，病死率約為33.9%[22]。目前臨床常用的鑑定的酵母菌的方法主要有顯色培養法和生化鑑定儀，但是這兩種方法都耗時較長，並且顯色培養法的結果判定易受主觀因素的影響。MALDI-TOF MS的應用使得念珠菌的藥敏試驗從至少24h縮短至3-6h，樣品製備僅需孵育、離心、提取和點樣，每個菌株只需要15min，並且可以同時取得耐藥結果，大大縮減了臨床工作。因此，基於MALDI-TOF MS的方法憑藉其敏感性和特異性等方面的優勢以及其快速準確等特點註定將替代傳統技術。
五、MALDI-TOF MS在抗生素敏感性檢測中的應用
在完成致病微生物的鑑定後，抗生素敏感性試驗（Testing for antibiotic susceptibility，AST）對指導抗生素的使用同樣有重要作用，儘管MALDI-TOF MS在微生物的鑑定中的使用越來越多，但常規AST仍然主要依賴傳統和分子技術[23]，如紙片擴散法、稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法）、抗生素濃度梯度法（E-test法）以及PCR等，而MALDI-TOF MS引入不久後也被應用於AST。原則上，任何通過化學衍生物使抗生素失活而導致質譜峰偏移的耐藥機制都可以被檢測到，例如碳青黴烯酶是內醯胺類抗生素的內醯胺環水解酶，許多碳青黴烯酶幾乎能識別所有的水解內醯胺，而且大多數都能抵抗普通β-內醯胺酶抑制劑的抑制[24]。另一種觀察菌株對特定抗生素或一類抗生素耐藥性的方法是分析目標分子，這些分子經過修飾後可產生耐藥性。MRSA可能是PBP2α，是轉肽酶家族的一個亞群，是細菌細胞壁合成所必需的，然而，PBP2α的大小使得它無法進行快速簡單的質譜分析[25]。單個核糖體蛋白，使菌群對抑制蛋白質生物合成的抗生素（如鏈黴菌素）具有抗性，例如大腸桿菌30s核糖體蛋白中S7的缺失，這些核糖體蛋白的突變導致耐藥性可能被快速和簡單的質譜分析檢測出來。
六、討論
MALDI-TOF MS是一種新興的微生物鑑定技術，具有高通量、低成本、高精度等優點，對於常規臨床微生物檢驗有重要作用。其鑑定的標本可以來源於BCs陽性、尿液或其他體液，以及瓊脂平板和肉湯培養基等生長的菌株。已有大量研究證明了其可靠性和準確性，但目前其應用仍存在一些局限，例如，MALDI-TOF MS不適用於區分志賀菌（Shigella）和大腸埃希菌（E. coli）[26]，百日咳博德特菌（Bordetella pertussis）和支氣管炎博德特菌（B. bronchiseptica），木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）和ruhlandii無色桿菌（A. ruhlandii），諾氏擬桿菌（Bacteroides nordii）和salyersiae擬桿菌（B. salyersiae）。肺炎球菌（pneumococci）、綠色鏈球菌（viridans streptococci）也容易被MALDI-TOF MS錯誤鑑定。陰溝腸桿菌複合體是一組包含6種相近的物種，他們具有相似的耐藥性模式，目前也尚不能區分[27]。此外，有些菌株中有一小部分具有非常相似的遺傳背景或廣泛的中間多樣性，無法通過質譜信號加以區分，難以獲得可信度較高的鑑定結果。微生物鑑定的精度很大程度上取決於資料庫條目的數量，對於絲狀真菌鑑定的局限性也主要由於參考的譜圖，因此，為了提高資料庫的性能，必須不斷地對參考資料庫進行更新，譜圖的不斷更新和升級以及樣本的富集優化能夠大幅提高鑑定的效率和效果。資料庫的進一步完善可以快速識別抗生素耐藥性特徵和耐藥性，也可以直接識別尿液樣本和BCs中的病原體。該技術在未來的診斷實驗室中具有重要的應用前景。在抗生素敏感性檢測中，標誌物的選擇和背景是檢測的關鍵因素，即蛋白質中的胺基酸序列和翻譯後修飾與個體抗性的關聯，以及該標誌物表達合成的穩定性。例如，MRSA和KPC的生物標記只對特定類型的耐藥菌株有效，陰性結果並不能證明其缺乏耐藥。綜上所述，MALDI-TOF MS在臨床的應用有廣闊的前景，同時亦存在一些局限性，需要進一步完善。
參考文獻略
註：本文來源於《臨床實驗室》雜誌2020年第10期「感染性疾病」專題