答：（1）儘量選擇靶向所有轉錄本共用的外顯子區域設計sgRNA。因為真核生物的基因包含外顯子和內含子，利用這些內含子和外顯子，一個基因可以剪接出多個轉錄本，翻譯後得到多個蛋白。設計條件性敲除的時候，首先要搞清楚這個基因有幾個轉錄本，一般敲除所有轉錄本共用的外顯子。
（2）優先選擇在基因的第一或第二外顯子區域設計sgRNA，以提高基因敲除效率。
2. 有哪些sgRNA免費設計的網站或軟體可以使用？
答：
（1）https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
（2）http://chopchop.cbu.uib.no/
（3）http://crispor.tefor.net/
（4）www.rgenome.net/cas-designer/
（5）http://zifit.partners.org/ZiFiT/
（6）http://grna.ctegd.uga.edu
（7）http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
3. 設計合成的sgRNA需要包含PAM序列嗎？
答：CRISPR序列是一個DNA序列（不包括PAM），在使用軟體設計CRISPR序列時，需要將目標DNA序列（包括假定的PAM序列）都輸入，如果沒有PAM，就不可能設計出CRISPR序列。
sgRNA是RNA形式的分子，sgRNA引導Cas9靶向識別CRISPR序列，其中的PAM位點作為CRISPR序列在基因組上的一個標記，對Cas9靶向識別目的序列至關重要，Cas9的兩個核酸內切酶結構域將PAM前的3-4核苷酸間的3'-5』磷酸二酯鍵切斷，對目的基因進行編輯。合成的sgRNA中不包括PAM序列。
4. 選擇sgRNA是按照軟體中評分由高到低考慮嗎？
答：有些設計網站的評分是依據研究論文，但在數據樣本量不是太大的情況下，並不能代表在真實細胞株中的sgRNA活性，所以效率評分僅能作為參考。選擇crispr時，不能在基因組中存在明顯的脫靶位置的序列。
原則上是優選那些脫靶機率低的sgRNA，判斷目標序列與候選脫靶序列的相似性，儘可能選那些候選脫靶序列具3個mismatch的，然後再參考評分由高到低進行選擇。
5. CRISPR序列是不是一定要加G、A或GG？
答：由於轉錄轉錄起始位點一邊是以嘌呤開始（主要是G，有時為A)，所以CRISPR序列一般以G開頭。如果crispr（20nt）序列的前2 nt是GG，在以T7啟動子（前17 nt)為驅動的體外轉錄中，當然是最好。如果crispr（20 nt)不是以G開頭，可以加1-2個G，多了1-2G的sgRNA被證明不影響spCas9識別crispr序列的活性，但不能有效引導espCas9（保真版Cas9）識別crispr序列。
6. 在同一個基因上設計2個sgRNA，這兩個sgRNA距離多遠合適？
答：如果實驗目的是希望敲除這個基因，兩個sgRNA之間的距離越近越好，距離最長不要超過 200 bp。如果是希望在一個基因上製造出兩個Indel突變位點，則建議相距200 bp之外，越遠越好。
7. 如果做RT-PCR驗證，引物是不是需要特異性針對設計sgRNA對應的轉錄本？
答：是的，需要設計特異性引物將靶向突變位置的cDNA擴增出來。由於基因組上基因組序列的改變可能會影響原始mRNA的剪接，因此設計引物時，最好是在目標序列的前面和後面的外顯子上分別設計正反向引物。
8. 是通過測序結果比對sgRNA附近的位點是否出現突變，來判斷基因編輯結果嗎？
答：DNA雙鏈斷裂一般出現在PAM位點前的3-4 bp之間。非同源重組修復也發生在此位置的附近，當然也會有較大片段刪除的情況出現。