不同於流式細胞術、微流控技術等其他細胞分選方法，依賴於拉曼光譜學（Raman spectroscopy）的技術不需要對細胞進行標記，且在許多應用中較流式細胞術敏感性和特異性更高。
隨著檢測設備和分析方法的快速發展，拉曼光譜學技術在生命科學領域越來越受到青睞.。
自動化拉曼光譜儀可以在單細胞層面進行功能分析，篩選對某種物質具有代謝活性的細胞用於後續分析，使得微生物生態的研究更加具有針對性和精確性。
2019年3月《Nature microbiology》期刊上，「自動化拉曼光譜儀用於活細胞功能分類」介紹了一個微流控光學平臺結合了微流體、光鑷和拉曼光譜技術，用於對穩定同位素標記的微生物細胞進行自動化分類，可以產生適合後續單細胞基因組學、微型宏基因組學以及純培養的活細胞。
An automated Raman-based platform for the sorting of live cells by functional properties
自動化拉曼光譜儀用於活細胞功能分類
作者：Kang Soo Lee, Márton Palatinszky, Fátima C. Pereira et aI.
期刊：Nature Microbiology (IF=14)
時間：18 March 2019
本文描述了這個基於拉曼光譜的細胞分類技術的設計與優化，並舉例操作了四個模式細菌（包括2個腸道、1個土壤和1個海洋），展示了這項技術高的分類精度（98.3 ± 1.7%）、高的通量（200–500細胞每小時、3.3–8.3細胞每分鐘）以及培養的兼容性。使用這項技術用於細菌宏基因組分析研究小鼠結腸粘蛋白降解，結果顯示多種細菌（包括Muribaculaceae科的一些物種）參與其中，突出了這個生態位的複雜性以及拉曼光譜細胞分選用於鑑別所研究生態過程中關鍵物種的潛力。
環境以及宿主關聯的微生物組研究旨在了解複雜微生物群落的組成及功能。單細胞研究越來越重要，因為其可以提供系統發育和基因組多樣性、表型和微環境的異質性、微生物與宿主及病毒之間關聯的信息。通過在微生物群落中添加同位素標記的化合物，生理的原位分析也可以在單細胞水平實現。微生物細胞可以消耗這些化合物並整合到自己的生物量中，這時候可以通過自動射線照相技術、納米級二次離子質譜或顯微拉曼光譜技術來追蹤這些同位素。為了鑑定消耗這些化合物的細胞，這三種技術可以和螢光原位雜交結合在一起使用。
理論上，微生物學家可以對複雜微生物群落中的單個細胞進行功能分析，並直接獲取那些具有所研究功能的細胞的基因組。然而目前所有的單細胞基因組研究中，單個細胞是隨機抽取的或者根據某些遺傳特徵使用PCR、螢光原位雜交抽取。最近有兩種方法可以基於代謝活性選擇微生物細胞進行全基因組擴增與測序，一是通過生物轉錄翻譯帶螢光標記的胺基酸序列標籤然後進行螢光激活細胞分選（FACS）；另一種是通過使用重水培養用穩定同位素氘進行標記，含氘的細胞可以使用拉曼光譜C-D指紋區域（2,040–2,300cm−1）進行鑑別。這種方法具有無破壞性、無需固定細胞、可以檢測樣品中所有代謝活性細胞的優點。使用這種方法，可以檢測當某種特殊化合物出現時具有活性的細胞，而這種化合物自身不需要標記。我們可以在毛細管中檢測拉曼光譜，並將氘標記的細胞通過光鑷進行分離。
本文介紹了一個全自動化的微流控平臺用於激活拉曼光譜的微生物細胞篩選，該平臺具有較高的通量，可以基於功能對細胞進行分選從而用於後續的培養、微宏基因組以及單細胞基因組分析。與以前的技術相比，該平臺不需要細胞含有能增強拉曼光譜檢測敏感度的化合物例如胡蘿蔔素，從而可以適用於更大範圍的細菌、古菌以及所有的真核細胞。
RACS平臺使用微流控裝置來捕獲與移動微生物細胞，用於後續的拉曼光譜測量與細胞分選。此裝置依賴於三維微流道技術來控制樣品流在聚二甲基矽氧烷(PDMS)微流體分選器中的位置。如圖1a所示，首先使用垂向鞘流將水平流動的樣品聚集到玻璃蓋玻片附近，從而保證光鑷較高的捕獲率並使用鞘液將樣品與PDMS隔開防止其對拉曼光譜的幹擾（注sheath flow：微流控中的鞘流技術，在細胞計數中為了避免細胞從小孔邊緣處流過及湍流、渦流的影響，用毛細管對準小孔管，細胞混懸液從毛細管噴出。同時與四周流出的鞘液一起流過敏感區，保證細胞混懸液在中間形成單個排列的細胞流，四周被鞘液圍繞），實際效果如下面視頻1所示。而之所以使用玻璃而不是石英的蓋玻片，是為了防止在光譜檢測區的幹擾（排列規則的晶體拉曼光譜更強）。在水平向樣品流的下遊，設置另一處鞘流，使得細胞在默認情況下流向廢液流出口（實際效果如視頻2所示）。
視頻1. 鞘流技術使細胞集中
視頻2. 鞘流使細胞默認流向廢液出口
RACS平臺的核心是一臺商用的共聚焦拉曼顯微鏡。在RACS平臺運行過程中，首先使用CCD相機1對兩束雷射進行聚焦，之後分光鏡（注beam splitter：分光鏡，就是部分反射部分透射的介質，一般是半反射半透射的，通過鍍膜控制反射透射的比例）被移除，之後拉曼顯微鏡開始進行操作。細胞的捕獲、運輸和釋放過程通過CCD相機2來監測，拉曼顯微鏡的載物臺可以移動從而實現蓋玻片下方10μm處的聚焦點可以進行分選。
圖1. RACS平臺的設計與工作原理（a. 樣品流中的細胞水平進入微流控裝置，並通過垂向和水平向的兩個鞘流進行控制，使其單個排列流過，默認情況下流向廢液出口，綠色圓圈中被光鑷捕捉的細胞移動到遠離樣品的鞘流區進行拉曼光譜測量，檢測到的標記細胞被釋放到收集出口，而未被標記的細胞則帶回樣品流釋放到廢液出口 b. 微生物細胞被限制在光鑷中 c. 歸一化的細胞中拉曼光譜信號分布 d. 整個平臺配置流程圖，拉曼測量光源和光鑷光源由雷射器產生並通過60倍物鏡被聚焦到微流控裝置的同一位置，CCD相機1用來雷射校對，之後可移動的分光鏡去除，在檢測中攜帶散射光的混合光被導向波譜分析儀用於拉曼光譜分析，過程中使用過濾器過濾掉雷射光源的光，微流控裝置下方有環形光源，以幫助CCD相機2實時監控細胞分選過程）
對於單個細胞，如果檢測到可靠的拉曼光譜標準證明其含有氘，那麼便將其釋放到收集出口而非廢液出口。本文使用三個革蘭氏陰性（兩個腸道的一個海洋環境）與一個革蘭氏陽性（土壤環境）細菌物種（Escherichia coli，Salmonella typhimurium，Marinobacteradhaerens和Bacillus subtilis）為例，通過波長1620-1670 cm−1之間的拉曼光譜信號的增強來判斷細胞出現在光鑷之中（如圖3a所示），因為這一區域不受PDMS和玻璃的影響，因此細胞指數可以通過有細胞存在時的信號與空白對照的比值來計算：
使用CCD相機2進行觀測發現光鑷中出現細胞總會有PC>1.0（無論是否氘標記），且含有氘標記的PC值稍低於未標記細胞，四個物種的PC值對比如圖3c所示，根據評估選用PC>1.7（PC>1.2對於M. adhaerens）作為光鑷捕獲細胞的判斷依據。用戶可以設置CCD相機2的閾值來自定義光鑷捕獲標準。
如圖2a所示，一旦成功捕獲細胞，RACS平臺移動包含細胞的光鑷到評估區域，然後根據拉曼光譜C-D指紋區域（2040–2300 cm−1）判斷細胞是否含有氘標記。標記指數可以通過波長2040–2300 cm−1區域與1850–1900 cm−1區域的信號比值來計算：
選擇波長1850–1900 cm−1區域作為參考是因為其對於設備材料PDMS和玻璃不敏感（而且經過前面判斷已經確定包含細胞，不用再考慮空白液體的光譜）。不同物種標記的和未標記的細胞PL值如圖3d所示，所有未標記的細胞PL<6.69，因此可將PL>6.69作為可靠的氘標記判斷標準。
如圖3b所示，經過反覆測量顯示細胞拉曼光譜測量時間越長，PL與PC值越穩定，PC值需要2秒時間測量足以穩定，而PL值需要5秒時間。根據這個參數，全自動化的RACS平臺分選細胞的速度達到200細胞每小時（也即3.3細胞每分鐘）。
圖2. 微流控裝置內的細胞分選操作（a. 微流控分選的監控圖，因為裝置反光，光鑷周圍可以看到環形照明燈，CL為捕獲區域，EL為評估區域，光鑷在這兩個區域之間往復移動 b-e. 氘標記細胞的分選過程，最終在評估區域釋放被帶入收集出口 f-i. 未標記細胞被帶回捕獲區域釋放，被帶入廢液出口）
RACS平臺提供一個用戶友好的程序界面，用戶可自定義篩選標準，操作方法如視頻3所示。首先進行空白校對（calibration），然後根據用戶設計的標準光鑷在捕獲區樣品流中隨機捕獲細胞，根據PC判斷是否成功捕獲，捕獲成功後移動到評估區進行拉曼光譜測量，如果滿足標記細胞的標準則釋放，細胞進入收集出口，否則帶回捕獲區的樣品流中釋放。
視頻3. RACS平臺界面及操作流程
圖3. RACS平臺示例菌株及分選標準（a. 背景流體與標記和未標記的大腸桿菌細胞拉曼光譜比較，彩色條帶分別展示了計算PC與PL所依據的波譜區域 b. 氘標記的大腸桿菌細胞PC與PL指數隨測量時間的變化，熱圖為標準化的拉曼光譜 c. 四個測試的物種其標記與未標記細胞的PC指數對比 d. 四個測試的物種其標記與未標記細胞的PL指數對比 e. 準確率評估測試中檢測的185個大腸桿菌細胞拉曼光譜對比）
為了檢測該平臺分選的準確率，作者將同一物種氘標記和未標記的細胞以1：1比例混合到一起進行分選。如圖3e所示，在捕獲的185個大腸桿菌細胞中，100個被篩選，85個被拒絕。被篩選的大腸桿菌細胞中99.0%的細胞其拉曼光譜展示了明顯的C-D峰，另外兩個檢測的物種分別為85.7%和96.4%。那些沒有典型C-D峰但是被篩選的細胞主要是由於在光鑷移動過程中細胞脫離了控制，在評估區進行測量時實際上測的是空白流體的PL值，而其值是高於6.69的。為了解決這個問題，作者總結了細胞丟失可能造成的六種情況（附件圖1所示），從而預測潛在的誤差（也即篩選了未標記的細胞），結果顯示三個物種的誤差分別為E. coli（0.3%）、B. subtilis（5.1%）和S. typhimurium（1.2%）。
附件圖1. 細胞從光鑷丟失的6種可能情況
接下來作者進一步通過實驗評估RACS平臺。首先評估回收效率，也即實際收集出口收集到的細胞數目與平臺檢測出氘標記細胞信號的數目之比。作者將氘標記的大腸桿菌細胞使用DAPI染色（附件圖2a所示），然後輸入平臺進行連續一小時的運行分選，收集到的細胞在螢光顯微鏡下進行計數，最終計算可得回收效率為82.1± 2.7%。接下來評估分選準確率，作者將沒有氘標記的大腸桿菌細胞用DAPI染色，並與氘標記的細胞進行1比1混合（附件圖2b所示），然後輸入平臺連續一小時的運行分選，然後檢測收集的細胞中DAPI染色細胞（也即未標記細胞）的數目，最終結果為準確率98.3± 1.7%。
附件圖2. RACS平臺回收效率與準確率評估方案
需要注意的是，該平臺不一定只分選氘標記的細胞，事實上只要找到足夠的拉曼光譜特徵，RACS平臺可以分選任何化合物或染料標記的細胞。
為了展示RACS平臺對複雜微生物群落的應用，選擇小鼠腸道樣品進行測試運行。複雜微生物群落的測試對RACS平臺有很大挑戰，首先腸道微生物組物種多樣性很高，細胞形態和大小也不盡相同。為了檢測光鑷是否能隨機的捕獲所有微生物細胞還是偏向於某種形態和大小的細胞，作者先根據PC>1.1的標準隨機捕獲分選細胞，然後使用16S測序分析原始微生物群落與分選後的微生物群落結構。結果顯示原始樣品中20個高豐度（>1%）的OTU中13個被成功捕獲分選，包含了小鼠腸道微生物組的主要門類（Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和Verrucomicrobia），證明RACS平臺具有在複雜微生物群落裡捕獲多種細胞的能力（附件表1）。儘管如此，豐度最高的OTU並沒有被成功捕獲分選，然而這個偏倚可能不是RACS平臺造成的，細胞裂解方法與全基因組擴增的偏倚也可能造成這種現象。
附件表1. 小鼠結腸微生物組主要OTU的捕獲分選情況
將小鼠結腸微生物組的細胞使用葡萄糖在沒有重水進行培養，也即所有細胞不做氘標記，輸入平臺發現所有細胞均有PL<6.14。然後將小鼠結腸微生物組的細胞使用葡萄糖在有重水條件下進行培養，也即所有細胞都做氘標記，根據PL>6.14作為判斷標記的標準進行分選，如附件圖3b所示37%捕獲的細胞被成功分選，這個效率可以與人工分選媲美。
附件圖3. 小鼠結腸微生物組細胞按照PC>1.1與PL>6.14標準的分選效率
最後，將小鼠結腸微生物組的細胞使用粘蛋白在有重水條件進行培養，使得代謝粘蛋白的細胞被氘標記，使用RACS平臺分選了180個細胞（如圖4a所示），然後使用宏基因組學的方法進行分析。16S分析結果顯示分選獲得的物種在原群落中佔比為27.4 ± 6.8%，而在RACS平臺捕獲的細胞裡，最終確定為氘標記並分選的細胞佔比23.7 ± 9.9%，這兩個比率十分一致再次證明了RACS平臺的可靠性。粘蛋白降解有關的微生物具有較高的系統發育多樣性，屬於4個門類Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria和CandidatusSaccharibacteria（如附件圖4所示）。
附件圖4. 粘蛋白降解有關物種系統發育樹
對25個宏基因組分裝獲得的高質量基因組進行分析，發現大部分和厚壁菌門中未培養的科Muribaculaceae是近緣的（如附件圖4所示）。在這些基因組中搜尋涉及粘蛋白降解有關的酶（如圖4b所示），發現84%的基因組至少能夠編碼一種能夠打破粘蛋白聚糖的酶（如圖4c所示）。
圖4. 使用RACS平臺分析小鼠結腸微生物組中與粘蛋白降解有關的微生物（a. 降解粘蛋白的標記細胞的判斷標準及其分選結果 b. 粘蛋白降解的代謝通路及相關的酶 c. 獲得的25個基因組中粘蛋白降解酶的出現情況，實心方塊表示在基因組中出現，實心圓圈表示在該基因組最近緣的物種中又出現，空心方塊表示不出現）
對微生物學家來說，單細胞基因組學研究的一個最大限制就是基於功能屬性將單個細胞進行分離。RACS平臺的出現就是為了填補這個缺口，它適合基於代謝活性對活細胞進行分選，以方便後續的研究。RACS平臺提供用戶友好的界面，方便用戶制定個性化分選程序，且以較高的通量進行全自動化運行（最高可達500 cells h−1）。並且經過驗證，RACS平臺具有很高的準確率且有處理複雜微生物群落的能力。可以期待藉助此平臺能更好的解決現代微生物生態中的關鍵問題，尤其是某些重要生物化學過程的關鍵參與物種。