非洲豬瘟疫情在全球呈蔓延趨勢，疫苗研究極為迫切。ASFV Georgia 2007分離株(ASFV-G)是造成目前歐洲和亞洲疫情的主要毒株。含有病毒相關基因缺失的ASFVs可以在豬體內產生減毒表型和誘導保護性免疫。
美國學者Elizabeth Ramirez-Medina等人在前人所做研究的基礎上做了一些探索，試圖產生安全有效的基因缺失減毒活疫苗，結果並不理想。
本文對ASFV的毒力影響因素進行了探討。作者認為合理開發新型ASFV疫苗需要謹慎，避免直接將特定病毒株的特定基因缺失所獲得的結果傳播到新的野外病毒株。
文章及作者信息如下：
ASF是豬的一種傳染性病毒性疾病。ASFV是一種大包膜病毒，含有約190kbp配對的雙鏈DNA基因組。ASFV與其他大型dsDNA病毒（例如痘病毒科，虹膜病毒科和藻類病毒科）具有相同的基因組結構和複製策略。ASF引起的一系列疾病，從高致死到亞臨床症狀，均取決於宿主特徵和病毒株的毒力。家豬的ASFV感染通常是致命的，以高燒，出血，共濟失調和嚴重抑鬱為特徵。
目前疫苗研發取得了一些進展。研究表明，當同源親本病毒攻擊時，用含有特定病毒相關基因缺失的減毒活疫苗免疫的可以豬受保護。ASFVs病毒基因組中缺失UK（DP69R）基因、23-NL（DP71L）基因、TK（A240L）基因、9GL（B119L）基因、 MGF360-530的6-9基因和DP148R基因，可導致對豬的毒性減弱。使用經過修飾的重組病毒免疫的動物，在受到其同源親本病毒的感染時能夠免受疾病的侵襲。到目前為止，這些研究結果是合理開發減毒病毒株的實驗證據。
基因缺失可能成為合理開發針對不同分離株的減毒活疫苗的方法學基礎。然而，大多數基因缺失，僅在少量的病毒分離物中進行了測試。將高度保守的9GL基因從三個不同ASFV菌株（Malawi, Pretoria和Georgia 2010）中敲除，導致了不同效果的毒力衰減。缺失NL基因完全減弱了E70菌株的毒力，但沒有影響Malawi中的毒力。敲除UK，DP148R和兩種不同類型的MGF360-530，僅在一種病毒分離株中進行了評估。
與毒力相關的病毒基因的識別和鑑定，對於ASFV疫苗的開發是至關重要的。我們研究了ASFV Georgia 2010 (ASFV-G)菌株缺失NL (DP71L)和UK (DP96R)兩個病毒基因後的差異，這兩個基因最初被認為是ASFV E70株病毒毒性的決定因素。
我們試圖通過刪除NL基因來增加以前報導的實驗性疫苗ASFV-GΔ9GL/ΔUK的安全性，產生基因缺失病毒ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK。雖然ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK可以在豬巨噬細胞的原代細胞培養中複製，但它在豬中表現出嚴重的複製缺陷，未能誘導針對親代ASFV-G感染的保護作用。
儘管兩種病毒基因的胺基酸序列在E70和Georgia毒株之間是高度保守的，但我們的結果顯示，與親本病毒相比，ASFV-G基因組的UK缺失（ASFV-G-ΔUK）毒力並沒有降低。NL基因的缺失使ASFV-G部分減毒。我們得出結論，這兩種病毒基因的差異效應取決於病毒基因組中的其他因素。
材料與方法
細胞培養與病毒
從去纖維蛋白的豬血液中製備原代豬巨噬細胞，進行培養。
ASFV Georgia（ASFV-G）是由喬治亞州提比里西農業部（LMA）實驗室的Nino Vepkhvadze博士友情提供。
重組病毒的構建
感染和轉染豬巨噬細胞後，親本ASFV基因組與相應重組轉移載體同源重組，產生重組病毒ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK。
利用病毒ASFV-G 9GL和重組轉移載體p72mCherryΔNL/ΔUK，構建三基因缺失的ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK。
ASFV基因組的新一代測序（NGS）
從感染的細胞中提取ASFV DNA並如前所述進行定量。使用Illumina NextSeq測序儀測定病毒基因組的全長序列。
ASFV特異性抗體檢測
採用自行研製的ELISA法對感染動物血清中的ASFY抗體進行定量。
動物實驗
根據美國農業部和國土安全部動物保護和使用委員會批准的方案，在梅蘭島動物疾病中心(PIADC)的動物設施中，3AG級生物安全條件下進行動物實驗。使用80-90磅的商業品種雌性豬評估ASFV-G-重組病毒相對於親本ASFV-G病毒的毒力。每組5隻,肌肉（IM）接種104HAD50重組病毒或ASFV-G。在整個實驗過程中每天記錄臨床症狀（厭食，抑鬱，發熱，紫色皮膚變色，蹣跚步態，腹瀉和咳嗽）和體溫變化。
通過肌肉注射102HAD50高毒親本ASFV-G，評估ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在接種28天（dpi）後的保護作用。在整個實驗中每天記錄臨床體徵（如上所述）和體溫變化。
結果
ASFV NL（DP71L）和UK（DP69R）基因在E70分離株和Georgia 2010分離株中高度保守
從西班牙分離株E70的基因組中單獨刪除NL（DP71L）或UK（DP69R）基因，導致在實驗條件下接種於豬中病毒的毒力急劇下降。有趣的是，E70和Georgia 2010分離株之間基因的序列比較顯示出高度的保守性。NL（DP71L）和UK（DP69R）基因的胺基酸同源性分別為94％和96％（圖1）。此外，共有39個預測的ORF可用於UK（DP69R），並且觀察到28個預測ORF保持高比例的同源性（>90％）;7個在80％和90％之間，4個在70-80％之間。在NL（DP71L）中，39個預測的ORF保持高百分比的同源性（>90％）。E70和Georgia 2010分離株之間，這兩個基因具有高度同源性，將預測它們在Georgia 2010基因組中的個體缺失將在ASFV Georgia 2010感染的豬中具有相似的降低病毒毒力的表型。
圖1.從ASFV E70和Georgia 2007分離株獲得的全長非洲豬瘟病毒（ASFV）蛋白NL（DP71L）（A）和UK（DP96R）（B）的胺基酸序列的比對。
重組缺失突變體ASFV的構建
為了評估NL（DP71L）或UK（DP69R）基因對於病毒毒力的影響，使用ASFV-G作為親本病毒構建重組病毒，所述病毒單獨含有任一基因的缺失（分別為ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK）。
通過對高致病性ASFV Georgia 2010分離株的遺傳修飾，與重組質粒p72mCherryΔNL的同源重組，構建ASFV-GΔNL（圖2）。從ASFV-G病毒中刪除NL（DP71L）基因內包含胺基酸殘基1-52 AA的156bp區域，並通過同源重組用含有在ASFV p72晚期基因啟動子控制下的mCherry基因的基因盒替換（p72mCherry ）。使用ASFV-G作為模板和p72mCherryΔUK作為重組質粒，構建ASFV-GΔUK。敲除UK基因（DP69R）中包含胺基酸殘基1-85的255 bp區域，並用p72mCherry盒替換（圖2）。
圖2.在重組病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK和ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK中缺失的NL和UK基因區域的示意圖。虛線之間的區域用p72mCherry盒代替。核苷酸位置表明了相對於ASFV-G基因組的缺失邊界。
利用原代豬巨噬細胞培養的單層細胞，連續純化後獲得重組病毒。在原代豬巨噬細胞培養中擴增純化得到的病毒群，獲得病毒庫。
通過對每種重組缺失突變病毒進行全基因組測序，評估遺傳修飾的準確性，每種重組病毒基因組的完整性和原病毒種群的純度。使用獲得的ASFV-G-Δ9NL和ASFV-G-ΔUK的全基因組序列，並與親本ASFV-G的基因組進行比較。對兩種病毒的DNA序列的分析證實了設計的缺失的準確性，並且通過插入與p72mCherry盒相對應的核苷酸進行替換。
ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK在原代豬巨噬細胞中的複製
在原代豬巨噬細胞培養中評估ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK的體外生長特徵，利用多步生長曲線與親本ASFV-G進行比較（圖3）。以0.1 MOI感染細胞，並在第2,24,48,72和96 h收集樣品。結果表明，ASFV-G-ΔUK顯示出與親本ASFV-G病毒相似的生長動力學。根據感染巨噬細胞的時間點和MOI，我們發現，重組病毒表現出與親本病毒相似的滴度。ASFV-G-ΔNL表現出略微的複製減少。滴度比ASFV-G或重組ASFV-G-ΔUK低約10倍，但三種生長曲線之間沒有統計學差異，除了96 h時（p值=0.003），ASFV-G-ΔNL較低。在ASFV E70的背景下通過缺失NL 或UK基因獲得的結果，不影響病毒在原代豬巨噬細胞培養物中體外複製的能力。
因此，雖然刪除UK基因似乎不影響病毒在E70或Georgia分離株中複製，但與E70分離株中的同源基因的效果相比，Georgia分離株中NL基因的缺失似乎對巨噬細胞中的病毒複製具有輕微的不利影響。
圖3.重組病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK，ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK和親本ASFV-G的體外生長動力學。用重組病毒或親本ASFV-G病毒感染原代豬巨噬細胞（MOI=0.1）。在原代豬巨噬細胞培養中，用滴定法測定感染後指定時間的病毒產量。
NL (DP71L)或UK (DP69R)基因缺失對豬ASFV-G毒力的影響
從西班牙分離株E70的基因組中單獨刪除NL（DP71L）或UK（DP69R）基因後，在實驗條件下感染豬後，導致病毒毒力急劇下降。在這些報導中，觀察到肌肉注射重組缺失突變體的豬，當劑量高達104HAD50時，只會引起短暫的體溫升高。因此，我們決定評估相似的基因缺失是否同樣會影響高毒性ASFV-G分離株的毒力。ASFV-G-ΔNL和ASFV-G-ΔUK病毒接種在家豬中進行實驗，並與其親本強毒病毒進行毒力比較。
肌肉注射104HAD50ASFV-G的豬，4-5天內表現出體溫升高（>104°F）。豬發展出與該疾病相關的嚴重臨床症狀，包括厭食，抑鬱，紫色皮膚變色，步態蹣跚和腹瀉。隨著時間的推移，疾病的跡象迅速惡化，動物死亡或在5-6天瀕臨死亡時被安樂死（表1）。
表1. 與感染親本ASFV-G病毒相比，感染突變病毒ASFV-G-ΔNL或ASFV-G-ΔUK豬的存活率和發熱反應。
用肌肉注射104HAD50ASFV-G-D9UK的動物，表現出與親本病毒ASFV-G感染的動物中觀察到的、嚴重程度相當的臨床疾病。攻毒3-4天後，豬開始出現短時間的發燒，第5天時，動物死亡或因瀕臨死亡而安樂死。有趣的是，肌肉注射104HAD50ASFV-G-Δ9NL的動物呈現異質行為。一隻動物在第5天時突然死亡，在屍檢時出現與超急性疾病相似的臨床病變。剩餘的四隻動物，起初的21天在臨床上保持正常，與感染了親代病毒的動物相比，出現了遲發性亞臨床疾病。攻毒後第4天，開始出現短時間的發熱，然後在整個觀察期內出現周期性的體溫短暫升高（表1，圖4和5D）。
圖4.感染104HAD50的重組病毒ASFV-G-ΔNL，ASFV-G-ΔUK或親本ASFV-G動物的死亡率的變化。感染後21天的觀察期監測動物的動物死亡率。
通過HA定量檢測實驗動物感染病毒後，不同時間節點的病毒血症（圖5A-C）。感染親本ASFV-G毒株的動物，具有非常高的病毒血症直至其死亡。與感染ASFV-G的動物相比，感染ASFV-G-UK的動物在血液中具有比較高的病毒滴度，平均滴度僅在接種第4天時略微降低。根據臨床表現，在感染ASFV-G-ΔNL的組中，接種第5天時，死亡的動物呈現高病毒血症滴度，而其餘存活的四隻動物呈現異質反應。
其中一隻從第7天開始至觀察期結束，病毒血症滴度恆定較高（約106.36HAD50/mL，標準差為0.24）。第二隻動物表現出相似的動力學，平均滴度為104.99HAD50/mL，標準差為0.55，而第三隻動物的平均滴度為103.61HAD50/mL，標準差為0.82。這三隻動物的體溫都有周期性的短暫升高。最後，第四隻動物在測試的任何時間點都沒有出現任何可檢測的病毒血症。因此，病毒血症值與臨床疾病表現的嚴重程度和動力學密切相關。
圖5. ASFV-G（A），重組病毒ASFV-G-ΔUK（B）和ASFV-G-ΔNL（C）感染後病毒血症的滴度。（D）接種ASFV-G-ΔNL的豬的體溫變化。
令人驚訝的是，UK基因的缺失並沒有改變ASFV-G分離株的毒力，而NL基因的缺失不能完全減弱病毒毒力。考慮到E70和Georgia 2010分離株之間，NL和UK基因之間的高度同源性，強調了這兩個基因在ASFV毒力中的遺傳背景的重要性。
候選疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK中NL基因的缺失影響了其對親本病毒的保護作用
由於NL的缺失誘導了ASFV-G毒力的顯著降低，因此需要評估是否NL缺失會增加候選疫苗ASFV-G-Δ9GL/ΔUK的安全性。在此基礎上，通過從ASFV-G-Δ9GL/ΔUK基因組中刪除NL基因，開發了一種新的重組病毒ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK。通過NGS分析ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK基因組與親本ASFV-G-Δ9GL相比，唯一的基因組修飾是插入的p72mCherry盒取代NL和UK基因。
在豬巨噬細胞原代培養中進行了多步生長曲線實驗，評估ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在豬巨噬細胞中的體外生長能力，並與其他重組病毒和親本ASFV-G進行比較。結果表明，與ASFV-G-Δ9GL/ΔUK相比，ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的生長動力學減少約100倍，與親本ASFV-G病毒相比，減少1000倍（圖3）。
為了評估NL基因缺失對ASFV-G-Δ9GL/ΔUK保護作用的影響，肌肉注射104HAD50於動物體內（n=5），並在28天後，感染102HAD50的ASFV-G。結果發現，所有接種的動物在感染之前沒有臨床症狀。病毒血症動力學顯示ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK的複製水平非常低（圖6），與先前描述的ASFV-G-Δ9GL或ASFV-G-Δ9GL/ΔUK的複製水平不同。因此，由ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK感染引起的特異性ASFV抗體應答非常低（數據未顯示），與ASFV-G-Δ9GL/ΔUK誘導的反應相比大大降低。
圖6.用104HAD50的ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK感染後血液樣品中的病毒滴度。
病毒接種後，所有ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK免疫的動物與對照組動物出現一致的、在動力學和嚴重程度上難以區分的臨床疾病。兩組中的動物第4天時表現出臨床症狀，並且被6天時執行安樂死（表2）。同時，模擬接種疫苗的對照和ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK感染的豬之間的病毒血症的動力學或量級沒有檢測到差異。這些結果證明NL基因的缺失降低了ASFV-G-Δ9GL/ΔUK候選疫苗在細胞培養和體內複製的能力，並沒有誘導針對親本毒性病毒攻擊的保護。ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK在豬體內的低複製可能是其對強毒病毒的保護作用較差的原因。
表2 感染ASFV-G-Δ9GL/ΔNL/ΔUK的動物的生存率和發熱反應，並在28天後接種102HAD50的親本ASFV-G。
討論
目前為止還沒有疫苗可用於預防ASFV感染，已有報導減毒活疫苗可用於保護豬免受同源強毒株的攻擊，病毒通過細胞培養中的連續傳代以及遺傳基因突變產生致弱。通過基因工程獲得的減毒病毒通常涉及與病毒毒性相關的特定基因的敲除。
迄今為止，只有6種不同基因/基因組的獨立缺失能夠減弱ASFV的毒性：
ASFV E70分離株中NL（DP71L）或UK（DP69R）基因獨立缺失；
Malawi Lil-20/1，Haiti，Georgia 分離株TK (A240L)基因的敲除；
Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4和Georgia分離株中9GL（B119L）基因的敲除；
Georgia和Benin分離株MGF360/505的6或9個基因缺失；
Benin分離株中DP148R基因的缺失使重組缺失突變病毒在豬體內的毒力顯著降低。
這些候選毒株當受到相應的毒性親本病毒 (同源攻擊)的感染時能夠提供免疫保護。這些研究結果表明，通過對靶基因的基因調控來開發減毒重組病毒是一種有效的疫苗開發方法。不同ASFV分離株之間的交叉保護是一種非常罕見的，需要開發不同分離株特異性疫苗。由此提出了一個問題，即在不同的病毒分離株中，一個特定基因缺失的衰減效果是否可以重現。在這方面，尚缺乏深入的研究。
TK (A240L)基因是所有ASFV分離株中高度保守的基因， Vero細胞適應型Malawi Lil-20/1，Haiti H811和Georgia病毒獲得相似的毒力衰減水平，即使它作為潛在疫苗病毒的作用不同。
9GL（B119L）基因在目前測序的ASFV分離株中也是高度保守。從致命的Malawi Lil-20/1和Pretoriuskop/96/4中敲除該基因，有效地降低了病毒毒力，並誘導相應的保護作用，這是一種候選靶基因以產生減毒活疫苗。然而，最近的研究表明，在Georgia分離株中，9GL的缺失在毒力衰減方面沒有同樣的效果，因為只有當以低劑量接種時，才能觀察到9GL缺失的Georgia分離株的病毒毒力顯著降低。
NL基因在不同的病毒分離株中存在很大差異。有趣的是，NL基因以兩種不同的形式存在：長型（184胺基酸），在Malawi Lil-20/1分離株中發現，以及短型（70-72胺基酸），存在於迄今為止測序的大多數ASFV分離株中。在ASFV E70分離株（短型）中缺失該基因產生減毒病毒，而其在ASFV Malawi Lil-20/1（長型）中的缺失不會導致病毒的減毒。E70和Malawi Lil-20/1編碼的NL蛋白顯著不同，這可能解釋了分別接種缺失突變病毒的豬的表型差異。然而，NL基因和UK基因的短型，在所有ASFV分離株中都非常保守。蛋白質同源性表明NL和UK蛋白在ASFV分離株中高度相似，其中E70和Georgia分別具有超過94％和96％的胺基酸同源性，使得ASFV減毒不可能僅依賴於蛋白質分化。由於觀察到的表型很可能是多個基因的作用共同介導的，目前為止積累的證據很難推測在ASFV Georgia 2007分離株中究竟是哪些基因介導了毒性。在不同的ASFV毒株中，病毒相關基因的數量或功能可能改變NL和UK基因對特定毒株毒力總體平衡的內在作用。
雖然有研究表明，ASFV-G-D9GL候選疫苗的衰減增強，但UK基因本身並不是ASFV喬治亞分離株毒力的決定性因素。同樣，NL在ASFV-G分離株病毒毒力中的重要性並不完全類似於ASFV E70，這表明其他與病毒相關的基因可能與Georgia分離株病毒毒力有關。正如觀察到Malawi Lil-20/1，Pretoriuskop/96/4和Georgia分離株中9GL基因的缺失導致不同的表型，NL和UK基因的缺失也產生了類似的結果，表明ASFV毒力是多基因效應的結果。這些結果表明，在從兩個不同的ASFV基因組中刪除毒力相關基因後觀察到的差異表型效應取決於病毒分離株的基因組背景。
支持這一假設的證據是，ASFV毒株中插入一組MGF360/530，可以恢復刪除NL基因後的ASFV E70毒株的衰減。由於MGF基因的自然缺失，NL基因的缺失導致了ASFV E70分離株的表達減弱，這組MGF基因後來被證明是病毒毒力的關鍵。
因此，儘管E70和喬治亞病毒分離株的UK和NL基因的翻譯產物具有很高的胺基酸同源性，但其他遺傳因素也影響了ASFV的毒力。這些毒力的遺傳決定因素需要進一步的鑑定。這項工作表明，合理開發新型ASFV疫苗需要謹慎，避免直接將特定病毒株的特定基因缺失所獲得的結果傳播到新的野外病毒株。
本文僅代表原作者觀點，與平臺無關
趙雙成博士翻譯
汪孟航博士審閱
周盼伊整理排版