samtools是一個用於操作sam和bam文件（通常是短序列比對工具如bwa,bowtie2,hisat2,tophat2等等產生的，具體格式可以在消息框輸入「SAM」查看）的工具合集，包含有許多命令。以下是常用命令的介紹。
1.View
view命令的主要功能是：將sam文件與bam文件互換；然後對bam文件進行各種操作，比如數據的排序(sort)和提取(這些操作 是對bam文件進行的，因而當輸入為sam文件的時候，不能進行該操作)；最後將排序或提取得到的數據輸出為bam或sam（默認的）格式。
bam文件優點：bam文件為二進位文件，佔用的磁碟空間比sam文本文件小；利用bam二進位文件的運算速度快。
view命令中，對sam文件頭部（序列ID）的輸入(-t或-T）和輸出(-h)是單獨的一些參數來控制的。
Usage: samtools view [options] <in.bam>|<in.sam> [region1 [...]]
默認情況下不加 region，則是輸出所有的 region.
options:
-b output BAM
默認下輸出是 SAM 格式文件，該參數設置輸出 BAM 格式
-h print header for the SAM output
默認下輸出的 sam 格式文件不帶 header，該參數設定輸出sam文件時帶 header 信息
-H print header only (no alignments)
僅僅輸出文件的頭
-S input is SAM
默認下輸入是 BAM 文件，若是輸入是 SAM 文件，則最好加該參數，否則有時候會報錯。
-u uncompressed BAM output (force -b)
該參數的使用需要有-b參數，能節約時間，但是需要更多磁碟空間。
-c Instead of printing the alignments, only count them and print the
total number. All filter options, such as 『-f』, 『-F』 and 『-q』 , are taken into account.
過濾功統計功能
-c print only the count of matching records
-L FILE output alignments overlapping the input BED FILE [null]
-t FILE list of reference names and lengths (force -S) [null]
使用一個list文件來作為header的輸入
-T FILE reference sequence file (force -S) [null]
使用序列fasta文件作為header的輸入
-o FILE output file name [stdout]
-F INT filtering flag, 0 for unset [0]
Skip alignments with bits present in INT [0]
數字4代表該序列沒有比對到參考序列上
數字8代表該序列的mate序列沒有比對到參考序列上
過濾功能。如F12過濾只有雙端map的
-q INT minimum mapping quality [0]
比對的最低質量值，一般認為20就為unique比對了，可以結合上述-bF參數使用使用提取特定的比對結果
例子：
將sam文件轉換成bam文件
samtools view -bS abc.sam > abc.bam
BAM轉換為SAM
samtools view -h -o out.sam out.bam
提取比對到參考序列上的比對結果
samtools view -bF 4 abc.bam > abc.F.bam
提取paired reads中兩條reads都比對到參考序列上的比對結果，只需要把兩個4+8的值12作為過濾參數即可
samtools view -bF 12 abc.bam > abc.F12.bam
提取沒有比對到參考序列上的比對結果
samtools view -bf 4 abc.bam > abc.f.bam
提取bam文件中比對到caffold1上的比對結果，並保存到sam文件格式
samtools view abc.bam scaffold1 > scaffold1.sam
提取scaffold1上能比對到30k到100k區域的比對結果
samtools view abc.bam scaffold1:30000-100000 $gt; scaffold1_30k-100k.sam
根據fasta文件，將 header 加入到 sam 或 bam 文件中
samtools view -T genome.fasta -h scaffold1.sam > scaffold1.h.sam
2.Sort
sort對bam文件進行排序。一些軟體需要sort的bam或者sam文件，如stringtie，所以必須要sort使用；求depth時，也必須要sort；
Usage: samtools sort [-n] [-m <maxMem>] <in.bam> <out.prefix> -m 內存參數默認下是 500,000,000 即500M（不支持K，M，G等縮寫）。對於處理大數據時，如果內存夠用，則設置大點的值，以節約時間。-n 設定排序方式按short reads的ID排序。默認下是按序列在fasta文件中的順序（即header）和序列從左往右的位點排序。
例子：
samtools sort accept.bam accept.sort最終產生accept.sort.bam
3.merge
將2個或2個以上的已經sort了的bam文件融合成一個bam文件。融合後的文件已經sort過了的。
Usage: samtools merge [-nr] [-h inh.sam] <out.bam> <in1.bam> <in2.bam>[...]Options: -n sort by read names -r attach RG tag (inferred from file names) -u uncompressed BAM output -f overwrite the output BAM if exist -1 compress level 1 -R STR merge file in the specified region STR [all] -h FILE copy the header in FILE to <out.bam> [in1.bam]
例子：
4.index
必須對bam文件進行默認情況下的排序後，才能進行index。否則會報錯。
建立索引後將產生後綴為.bai的文件，用於快速的隨機處理。很多情況下需要有bai文件的存在，特別是顯示序列比對情況下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2顯示reads的比對圖形的時候也需要。IGV顯示比對情況也需要。
Usage: samtools index <in.bam> [out.index]
例子：
以下兩種命令結果一樣
$ samtools index abc.sort.bam$ samtools index abc.sort.bam abc.sort.bam.bai
5.faidx
對fasta文件建立索引,生成的索引文件以.fai後綴結尾。該命令也能依據索引文件快速提取fasta文件中的某一條（子）序列
Usage: samtools faidx <in.bam> [ [...]]對基因組文件建立索引，方便提取序列。
例子：$ samtools faidx genome.fasta
由於有索引文件，可以使用以下命令很快從基因組中提取到fasta格式的子序列
$ samtools faidx genome.fasta scffold_10 > scaffold_10.fasta
6.tview
tview能直觀的顯示出reads比對基因組的情況，和基因組瀏覽器有點類似。
需要事先利用利用上面講的sort和建index命令執行完後，用下述命令。
Usage: samtools tview <aln.bam> [ref.fasta]當給出參考基因組的時候，會在第一排顯示參考基因組的序列，否則，第一排全用N表示。按下 g ，則提示輸入要到達基因組的某一個位點。例子「scaffold_10:1000"表示到達第10號scaffold的第1000個鹼基位點處。使用H(左）J（上）K（下）L（右）移動顯示界面。大寫字母移動快，小寫字母移動慢。使用空格建向左快速移動（和 L 類似），使用Backspace鍵向左快速移動（和 H 類似）。Ctrl+H 向左移動1kb鹼基距離； Ctrl+L 向右移動1kb鹼基距離可以用顏色標註比對質量，鹼基質量，核苷酸等。30～40的鹼基質量或比對質量使用白色表示；20～30黃色；10～20綠色；0～10藍色。使用點號'.'切換顯示鹼基和點號；使用r切換顯示read name等還有很多其它的使用說明，具體按 ？ 鍵來查看。
7.flagstat
給出BAM文件的比對結果
Usage: samtools flagstat <in.bam>$ samtools flagstat example.bam11945742 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)#總共的reads數0 + 0 duplicates7536364 + 0 mapped (63.09%:-nan%)#總體上reads的匹配率11945742 + 0 paired in sequencing#有多少reads是屬於paired reads5972871 + 0 read1#reads1中的reads數5972871 + 0 read2#reads2中的reads數6412042 + 0 properly paired (53.68%:-nan%)#完美匹配的reads數：比對到同一條參考序列，並且兩條reads之間的距離符合設置的閾值6899708 + 0 with itself and mate mapped#paired reads中兩條都比對到參考序列上的reads數636656 + 0 singletons (5.33%:-nan%)#單獨一條匹配到參考序列上的reads數，和上一個相加，則是總的匹配上的reads數。469868 + 0 with mate mapped to a different chr#paired reads中兩條分別比對到兩條不同的參考序列的reads數243047 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
#同上一個，只是其中比對質量>=5的reads的數量
7.depth
得到每個鹼基位點的測序深度,並輸出到標準輸出，所以要用大於號追加到一個文件。
Usage: bam2depth [-r reg] [-q baseQthres] [-Q mapQthres] [-b in.bed] <in1.bam> [...]
-r 後面跟染色體號（region）
-q ：計算深度時要求測序鹼基質量最低質量值
-Q ：計算深度時要求比對的最低質量值
注意：做depth之前必須做samtools index；
例子
samtools depth accept.bam >depth
8.其他命令
reheader：替換bam文件的頭
$ samtools reheader <in.header.sam> <in.bam>
idxstats ：統計一個表格，4列，分別為」序列名，序列長度，比對上的reads數，unmapped reads number。第4列應該是paired reads中有一端能匹配到該scaffold上，而另外一端不匹配到任何scaffolds上的reads數。
$ samtools idxstats <aln.bam>
rmdup：將由PCR duplicates獲得的reads去掉，並只保留最高比對質量的read。
Usage: samtools rmdup [-sS]
-s 對single-end reads。默認情況下，只對paired-end reads-S 將Paired-end reads作為single-end reads處理。
9. 將bam文件轉換為fastq文件
有時候，我們需要提取出比對到一段參考序列的reads，進行小範圍的分析，以利於debug等。這時需要將bam或sam文件轉換為fastq格式。
該網站提供了一個bam轉換為fastq的程序：http://www.hudsonalpha.org/gsl/information/software/bam2fastq
$ wget http://www.hudsonalpha.org/gsl/static/software/bam2fastq-1.1.0.tgz$ tar zxf bam2fastq-1.1.0.tgz$ cd bam2fastq-1.1.0$ make$ ./bam2fastq <in.bam>
10. mpileup
samtools還有個非常重要的命令mpileup，以前為pileup。該命令用於生成bcf文件，再使用bcftools進行SNP和Indel的分析。bcftools是samtool中附帶的軟體，在samtools的安裝文件夾中可以找到。
最常用的參數有2：
-f 來輸入有索引文件的fasta參考序列； -g 輸出到bcf格式。用法和最簡單的例子如下
Usage: samtools mpileup [-EBug] [-C capQcoef] [-r reg] [-f in.fa] [-l list] [-M capMapQ] [-Q minBaseQ] [-q minMapQ] in.bam [in2.bam [...]]$ samtools mpileup -f genome.fasta abc.bam > abc.txt
$ samtools mpileup -gSDf genome.fasta abc.bam > abc.bcf$ samtools mpileup -guSDf genome.fasta abc.bam | \ bcftools view -cvNg - > abc.vcf
mpileup不使用-u或-g參數時，則不生成二進位的bcf文件，而生成一個文本文件(輸出到標準輸出)。該文本文件統計了參考序列中每個鹼基位點的比對情況；該文件每一行代表了參考序列中某一個鹼基位點的比對結果。比如：
scaffold_1 2841 A 11 ,,,...,.... BHIGDGIJ?FFscaffold_1 2842 C 12 ,$,,...,....^I. CFGEGEGGCFF+scaffold_1 2843 G 11 ,,...,..... FDDDDCD?DD+scaffold_1 2844 G 11 ,,...,..... FA?AAAA<AA+scaffold_1 2845 G 11 ,,...,..... F656666166*scaffold_1 2846 A 11 ,,...,..... (1.1111)11*scaffold_1 2847 A 11 ,,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAT.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG,+9acggtgaag.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG.+9ACGGTGAAG %.+....-..)scaffold_1 2848 N 11 agGGGgGGGGG !!$!!!!!!!!scaffold_1 2849 A 11 c$,...,..... !0000000000scaffold_1 2850 A 10 ,...,..... 353333333
mpileup生成的結果包含6行：參考序列名；位置；參考鹼基；比對上的reads數；比對情況；比對上的鹼基的質量。其中第5列比較複雜,解釋如下：
1 『.』代表與參考序列正鏈匹配。
2 『,』代表與參考序列負鏈匹配。
3 『ATCGN』代表在正鏈上的不匹配。
4 『atcgn』代表在負鏈上的不匹配。
5 『*』代表模糊鹼基
6 『^』代表匹配的鹼基是一個read的開始；』^'後面緊跟的ascii碼減去33代表比對質量；這兩個符號修飾的是後面的鹼基，其後緊跟的鹼基(.,ATCGatcgNn)代表該read的第一個鹼基。
7 『$』代表一個read的結束，該符號修飾的是其前面的鹼基。
8 正則式』\+[0-9]+[ACGTNacgtn]+』代表在該位點後插入的鹼基；比如上例中在scaffold_1的2847後插入了9個長度的鹼基acggtgaag。表明此處極可能是indel。
9 正則式』-[0-9]+[ACGTNacgtn]+』代表在該位點後缺失的鹼基；
11. 使用bcftools
bcftools和samtools類似，用於處理vcf(variant call format)文件和bcf(binary call format)文件。前者為文本文件，後者為其二進位文件。
bcftools使用簡單，最主要的命令是view命令，其次還有index和cat等命令。index和cat命令和samtools中類似。此處主講使用view命令來進行SNP和Indel calling。該命令的使用方法和例子為：
$ bcftools view [-AbFGNQSucgv] [-D seqDict] [-l listLoci] [-s listSample] [-i gapSNPratio] [-t mutRate] [-p varThres] [-P prior] [-1 nGroup1] [-d minFrac] [-U nPerm] [-X permThres] [-T trioType] in.bcf [region]
$ bcftools view -cvNg abc.bcf > snp_indel.vcf
生成的結果文件為vcf格式，有10列，分別是：1 參考序列名；2 varianti所在的left-most位置；3 variant的ID（默認未設置，用』.'表示)；4 參考序列的allele；5 variant的allele(有多個alleles，則用』,'分隔);6 variant/reference QUALity;7 FILTers applied;8 variant的信息，使用分號隔開；9 FORMAT of the genotype fields, separated by colon (optional)； 10 SAMPLE genotypes and per-sample information (optional)。
例如：
scaffold_1 2847 . A AACGGTGAAG 194 . INDEL;DP=11;VDB=0.0401;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,8,3;MQ=35;FQ=-67.5 GT:PL:GQ 1/1:235,33,0:63scaffold_1 3908 . G A 111 . DP=13;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,7;MQ=42;FQ=-63 GT:PL:GQ 1/1:144,36,0:69scaffold_1 4500 . A G 31.5 . DP=8;VDB=0.0034;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,3;MQ=42;FQ=-39 GT:PL:GQ 1/1:64,12,0:21scaffold_1 4581 . TGGNGG TGG 145 . INDEL;DP=8;VDB=0.0308;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,0,8;MQ=42;FQ=-58.5 GT:PL:GQ 1/1:186,24,0:45scaffold_1 4644 . G A 195 . DP=21;VDB=0.0198;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,10,10;MQ=42;FQ=-87 GT:PL:GQ 1/1:228,60,0:99scaffold_1 4827 . NACAAAGA NA 4.42 . INDEL;DP=1;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,1,0;MQ=40;FQ=-37.5 GT:PL:GQ 0/1:40,3,0:3scaffold_1 4854 . A G 48 . DP=6;VDB=0.0085;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,2,1;MQ=41;FQ=-36 GT:PL:GQ 1/1:80,9,0:16scaffold_1 5120 . A G 85 . DP=8;VDB=0.0355;AF1=1;AC1=2;DP4=0,0,5,3;MQ=42;FQ=-51 GT:PL:GQ 1/1:118,24,0:45
第8列中顯示了對variants的信息描述，比較重要，其中的 Tag 的描述如下：
Tag Format DescriptionAF1 double Max-likelihood estimate of the site allele frequency (AF) of the first ALT alleleDP int Raw read depth (without quality filtering)DP4 int[4] # high-quality reference forward bases, ref reverse, alternate for and alt rev basesFQ int Consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwiseMQ int Root-Mean-Square mapping quality of covering readsPC2 int[2] Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2PCHI2 double Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samplesPV4 double[4] P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance biasQCHI2 int Phred-scaled PCHI2RP int # permutations yielding a smaller PCHI2CLR int Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraintUGT string Most probable genotype configuration without the trio constraintCGT string Most probable configuration with the trio constraint
使用bcftools得到variant calling結果後。需要對結果再次進行過濾。主要依據比對結果中第8列信息。其中的 DP4 一行尤為重要，提供了4個數據：1 比對結果和正鏈一致的reads數、2 比對結果和負鏈一致的reads數、3 比對結果在正鏈的variant上的reads數、4 比對結果在負鏈的variant上的reads數。可以設定 （value3 + value4）大於某一閾值，才算是variant。比如：
$ perl -ne 'print $_ if /DP4=(\d+),(\d+),(\d+),(\d+)/ && ($3+$4)>=10 && ($3+$4)/($1+$2+$3+$4)>=0.8' snp_indel.vcf > snp_indel.final.vcf