基於質譜成像技術對蘆筍的可視化分析

摘 要:

隨著近年來人們對功能性食品的關注度越來越高，蘆筍被認為是對抗高血壓比較有效的一種食物。蘆筍中所含的Asparaptine是抗高血壓的有效成分，但是目前還沒有其在蘆筍內的分布信息的相關研究。我們利用基質輔助雷射解吸質譜成像（MALDIMSI）技術闡釋了Asparaptine 在蘆筍內的分布情況。

1. 背景介紹

已有研究表明蘆筍粗提取物有降低血壓的功效。長期以來蘆筍的降壓功效一直被認為是來源於其中所含有的某些含氮化合物，但近些年來，一些研究認為，蘆筍的降壓功效應該來源於其中的某些含硫化合物而非含氮化合物。

在這種背景下，2015年的一項研究發現了一種由精氨酸和蘆筍酸組成的新物質——Asparaptine1)。這項研究提出，Asparaptine的降血壓功效來源於其對血管緊張素轉化酶（ACE）的抑制作用。Asparaptine的發現使蘆筍作為功能性食品更受歡迎，因而對其也需要進行更加詳細的研究。作為研究此物質的一種方法，我們嘗試闡釋蘆筍中Asparaptine的定位信息。近些年來，MALDI-MSI作為一種可直接用肉眼觀察到各化合物定位信息的方法而備受關注。這種方法可以通過單次分析實現對大量分子信息的成像，並且由於其具有可區分靶向目標和代謝物的能力，目前已經被廣泛應用於諸如神經遞質可視化2)和藥代動力學成像3)的研究中。此外，除了在醫藥領域，MALDI-MSI技術也已經被應用於食品領域，涉及食品樣品的範圍非常廣泛，從作為日本的主要糧食的大米4)，到土豆5)和草莓6)。提供「可視化」信息，比如功能性化合物的分布信息，可以從增加食品附加值的角度來吸引消費者。

圖1展示了MALDI-MSI的標準操作流程。使用冷凍切片機將冷凍樣品切成厚度在10 μm至30 μm之間的切片。將冷凍切片放置在導電板上，例如塗有氧化銦錫(ITO)的載玻片。之後將作為輔助電離試劑的基質塗敷於樣品表面，然後進行質譜分析。在MALDI-MSI過程中，我們可以確定被測區域和測量點之間的距離，得到每個測量點的質譜和位置信息。通過選擇目標分子在每個測量點的質譜中的質荷比，我們可以從每個測量點的強度數值得到目標分子在樣品中的分布信息。在本研究中，我們按照上述流程進行實驗，以明確Asparaptine的定位信息。

圖1 MALDI-MSI的實驗流程

2. 實驗部分

2.1 樣品及樣品冷凍方法

將蘆筍按照尖部、中部和下端切成三份，使用切片機（CM1950）將三部分分別製成20μm厚度的切片。蘆筍的側面有三角形的葉片，稱為鱗片，其作用是保護枝杆(圖2A)。在這項研究中，對這四個部位均進行了成像。目標成分是之前已經描述過的Asparaptine。在MALD-MSI中，樣品的冷凍是影響成像結果的一個重要過程。在本研究中，我們將對液氮冷凍法和真空密封袋冷凍法兩種方式進行比較(圖2B)。前一種冷凍方法是將蘆筍包裹在鋁箔中，放入液氮中冷凍。後一種方法是將蘆筍放入真空袋中，將袋中抽成真空，然後在-80°C的冰箱中慢慢冷凍。為了比較這兩種方法，我們使用甲苯胺藍染色對組織切片進行檢查。

2.2 基質噴塗

我們通過噴塗的方式將α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)加載於樣品表面，基質溶液是10mg/mL的濃度(30%乙腈，10% 2-丙醇，0.1%甲酸)進行配製的。使用噴筆（PS-270）將400 μL基質溶液噴塗於樣品切片表面，噴槍的尖端與組織表面之間的距離保持在10 cm。

2.3 MSI分析條件

我們使用iMScope TRIO™(圖3)來進行MALDI-MSI分析。配置355nm Nd:YAG雷射光源，雷射頻率1000 Hz，每點雷射照射次數100，每個像素點累積次數為1次。雷射光斑直徑為25μm，強度為47，樣品電壓和檢測器電壓分別設為3.5 kV和2.1 kV。採集模式為正離子模式，採集範圍m/z 100-350, 並以Asparaptine的質子加和產物m/z 307.09作為前體離子進行二級質譜分析。

3. 結果與討論

3.1 樣品冷凍方法比較

將通過液氮冷凍和真空密封袋冷凍兩種方式進行冷凍的樣品切成20 μm 厚的切片，並將切片用甲苯胺藍染色，然後使用光學顯微鏡進行檢查（圖4）。如圖4A 中所示，使用真空袋冷凍的樣品製備切片有可能不損害樣品形態。另一方面，樣品經液氮冷凍後，由於在冷凍過程中會產生裂紋，使得樣品切片難以保持其形貌。樣品冷凍在真空密封袋裡，也同樣可以保持組織細胞的形態，而用液氮冷凍的組織細胞會被破壞，可觀察到很多包含裂縫的部分（圖4B）。真空密封袋冷凍的樣品之所以能夠保持細胞組織形態，其重要原因是高壓冷凍法原理髮揮了作用7)。通常情況下，當水結成冰時細胞內就會形成冰晶8)。然而，在高壓凍結方法中，通過在凍結過程中對樣品施加高壓(一般在2000 atm 左右)，水的熔點會降低，粘度會增加，所以通過這種方法可以抑制導致細胞組織破壞的冰晶的形成。在本實驗中，雖然沒有施加2000 atm 的壓力，但樣品可能在外力的作用下，產生了不同於常壓下凍結狀態的現象。另一方面，在使用液氮冷凍時，樣品本身可能會由於水的膨脹而產生了裂紋。同時，由於樣品在液體中沸騰，在樣品周圍形成一層氮氣層。一旦這種現象發生，冷凍效率將被極大降低。此外當使用高壓冷凍方法時，水以非晶形態凍結的深度是5 到20 μm，而以液態氮冷凍時,這個深度可達5 到200 μm9）。這種現象在諸如蘆筍這樣的體積較大且含有大量水分的樣本中尤為明顯。根據上述原理，真空密封袋冷凍是一種又好又簡單的方法，它可以在冷凍植物樣品時保持樣品組織的形態。

3.2 Asparaptine 定位信息的可視化分析

在本實驗中，首先通過成像質譜來進行Asparaptine定位信息的可視化分析。如圖5A所示，代表Asparaptine的m/z 307.09的質譜峰被檢測到。然後通過在離子阱中的一級質譜篩選出m/z 307.09的碎片，再通過飛行時間質譜分析二級碎片離子信息，從而確認是否m/z 307.09的碎片來源於靶向物質。圖5B所示的質譜圖是由二級質譜獲得的，我們成功檢測到來自一級前體離子m/z 307.09的碎片離子m/z 248.05。由於m/z 248.05是Asparaptine結構可以產生的碎片離子，因此m/z 307.09被認為是Asparaptine的質譜峰。因此，採用m/z 248.05碎片離子對Asparaptine進行成像，結果如圖6所示。分析結果表明，Asparaptine的分布方式是從中心向外擴展，從下端向尖端擴展。同時在鱗片和維管束周圍分布有大量的Asparaptine。通過藉助MALDIMSI技術，我們成功實現了對一種此前尚不明晰其分布的物質的詳細定位信息的分析和確認。

4. 結 論

在本研究中，我們首次使用iMScope TRIO 對蘆筍中的Asparaptine 進行了定位分析。我們還發現冷凍法在植物樣品分析中具有重要的意義。通過藉助MALDI-MSI 這種有力手段，我們可以通過可視化的定位信息來獲得全新的發現，甚至對於那些合成機理和功能尚未明晰的物質也是如此。今後，把MALDI-MSI 應用於植物和食品樣品將有助於我們明確樣品中成分的定位信息，並有望在功能性食品的高效開發、目標物質合成機理的闡釋等方面得到更多應用。

5. 參考文獻

1) R. Nakabayashi et al., J. Nat. Prod., 78, 1179 (2015)

2) Enomoto Y. et al., Anal. Sci., 34(9), 1055 (2018)

3) Ohtsu S. et al., Anal. Sci., 34(9), 991 (2018)

4) N. Zaima et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 24, 2723 (2010)

5) S. Taira et al., Int. J. Biotechnol. Wellness Industry, 1, 61 (2012)

6) Anna C. Crecelius et al., J. Agric. Food Chem., 65, 3359 (2017)

7) H. Moor, U. Riehle, Proc. 4th Eur. Reg. Conf. Electron Microsc., 33 (1968)

8) H. Moor, Cryotechniques in Biological Electron Microscopy, 175 (1987)

9) Y. Ito, Plant Morphology, 25, 35 (2013)