帝國理工學院Molly Stevens教你如何定製膠凝化機理

水凝膠在化學和結構上具有多功能性，是常見的生物材料，可廣泛應用在組織工程、藥物遞送和細胞培養等。水凝膠是在溶膠-凝膠轉變過程中形成的，該過程可以通過設計不同的觸發因素來引發，這些觸發因素可以精確控制水凝膠化動力學和水凝膠結構。帝國理工學院Molly M. Stevens教授團隊對水凝膠設計的最新進展進行批判性概述，並綜述了一些觸發水凝膠形成的可用方法。作者描述了機理，優點和局限性，並基於它們是直接引發凝膠作用（本徵凝膠作用）還是通過從中間組分釋放凝膠引發劑（間接凝膠作用）提出新的凝膠引發劑分類系統。最後，作者評估了這些觸發因素在基礎和臨床生物醫學應用。該綜述有助於為新的水凝膠應用選擇觸發機制，並引導關於凝膠觸發機制的新設計。

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1水凝膠介紹

水凝膠被定義為「溶脹劑是水的凝膠」，凝膠是「非流體膠體網絡或聚合物網絡，它們在流體其中膨脹」。聚合物網絡可以是如膠原蛋白，纖維蛋白，瓊脂糖或藻酸鹽等天然材料。它們通常具有良好的生物相容性和生物降解性，但也可能帶來免疫原性，批次間差異以及機械性能較差等問題。合成的聚合物可解決這些問題，如基於聚乙二醇（PEG），聚丙烯醯胺（PAM）或聚乙烯醇（PVA）的聚合物。合成聚合物的設計更具靈活性，易於功能化和機械性能易改善，但它們缺乏可生物降解性。

2不同的凝膠網絡

2.1共價鍵

聚合物鏈之間的共價鍵形成網絡結構，該結構以足夠的交聯密度通過表面張力將水包封。對於生物醫學應用，最常見的鍵是由「點擊化學」反應形成的鍵，因為這些鍵可在環境條件下快速交聯。如銅催化的或應變促進的疊氮化物-炔烴環加成反應，麥可供體和受體的麥可加成反應，硫醇-烯反應，[4+2]環加成反應和二硫鍵的形成。共價交聯也是形成聚合物--納米顆粒水凝膠的一種途徑。

2.2靜電相互作用

水凝膠網絡也可以通過靜電相互作用來穩定。例如，金屬-海藻酸鹽水凝膠由螯合到相鄰生物聚合物鏈上的羧酸鹽的二價陽離子（例如Ca2+，Mg2+，Ba2+）組成。三價陽離子（例如Al3+，Fe3+）可以與三個羧酸根基團相互作用形成更緊密的網絡，從而生成具有高機械性能的金屬-藻酸鹽水凝膠。其他能夠形成離子交聯水凝膠的生物聚合物包括殼聚糖，果膠，纖維素，和聚半乳糖醛酸鈉。水凝膠也可以通過凝聚，即在水性介質中帶相反電荷的聚合物的液相-液相分離而生成，該過程主要由靜電相互作用驅動。

2.3其他非共價相互作用

水凝膠可以通過嵌段共聚電解質形成，其中離子嵌段賦予水溶性，而疏水嵌段則通過疏水作用驅動網絡形成。非共價水凝膠也可以由兩親物形成，利用如疏水作用、氫鍵、π-π相互作用和範德華相互作用進行凝膠化。這些系統通常需要疏水性和親水性之間達到微妙的平衡才能生成水凝膠。如果兩親物疏水性太強，則不能溶於水；如果其親水性太強，則沒有促進自組裝的驅動力。在中間條件下，這些兩親物通常會通過非共價交聯或纏結在形成網絡結構之前組裝成各向異性結構。組裝是由分子之間的相互作用受疏水作用、氫鍵、π-π相互作用和範德華相互作用驅動的。

2.4複雜的互穿網絡

由兩個或多個互穿的聚合物網絡組成的雜化系統可以提供介於組成水凝膠之間的物理和機械性能。在某些情況下，可以通過組合短鏈聚電解質和長鏈共價網絡形成雙網絡水凝膠來提高機械性能。拉伸載荷時，短鏈網絡中的鍵解離會耗散能量，而長鏈網絡會擴展以承受變形應變。因此，可以將雙網狀水凝膠設計為具有極高的彈性模量、破壞壓縮應力和撕裂斷裂能。通過使用具有非共價交聯的短鏈網絡，可以從應用變形中獲得更大的恢復。

3內在水凝膠觸發器

內在觸發因素是通過直接改變基礎材料的物理化學性質或通過直接加速交聯過程而引發水凝膠化過程的因素（圖 1A），包括溫度、成分混合、pH的變化、氧化態變化、酶添加和電磁輻射。

圖1水凝膠觸發器的示意圖。A）內在觸發因素包括使用溫度變化，組分混合，pH值變化和添加酶以形成網絡結構。B）間接觸發因素包括使用刺激來觸發反應性成分從載體中釋放或激活熱引發劑或光引發劑。

3.1溫度變化

熱觸發非常適合基礎科學和臨床醫學，特別是當溶膠-凝膠轉變發生在生物醫學通常使用的溫度範圍內（4–41°C）時。在此溫度範圍內，熱觸發最常用於引發非共價相互作用的形成，從而導致膠凝。並且，通過調整合成方法，熱凝膠化過程是可控的（如凝膠化溫度和速率）。這包括許多在高溫下可溶但在冷卻後會自組裝成水合纖維網絡的低分子量膠凝劑。當溫度升高時，合成材料也可以設計成凝膠。如，將具有較低的臨界溶液溫度（LCST）嵌段共聚物在親水性骨架內與熱響應性疏水鏈段（如N-異丙基丙烯醯胺）結合，可以在加熱時發生水凝膠化。這是由於這些聚合物溶液中的混合熵很低，可以通過聚合物與水的相互作用（即氫鍵）進行焓補償。隨著溫度的升高，氫鍵會降低，直到不再能補償疏水鏈段的熵損失

3.2成分混合

雖然溫度變化可用於直接影響單個生物聚合物的鍵結構，但其他膠凝機制需要混合兩種或多種液體組分。這種方法的一個例子是利用互補聚合物鏈之間的相互作用吸引力。還有一種方法是添加可以使用單一聚合物形成水凝膠網絡的交聯組分（如EDC），該交聯劑可以在聚合物鏈之間產生共價鍵，而無需整合到水凝膠網絡中。水凝膠也可通過整合到網絡結構中的交聯劑或者一系列「點擊」反應（圖 2）形成。非共價相互作用也可以用於水凝膠交聯。例如，添加離子可用於形成聚合物鏈之間的靜電相互作用。混合納米顆粒和聚合物也可引發水凝膠化。

圖2用於水凝膠交聯的「點擊」反應的示例。

3.3 pH變化

引入酸或鹼可引起pH誘導的膠凝化作用。例如，帶有可以質子化或去質子化的官能團的聚合物可以通過改變pH值進行可逆的自組裝。如膠原蛋白在低pH值的溶液中，側鏈殘基質子化，引起靜電電荷排斥，從而阻止三重螺旋的組裝。pH值中和可降低螺旋，導致凝膠形成。此外，還可以通過溶液pH的共價反應來介導水凝膠化，例如羥胺與醛或酮的反應形成肟鍵（C=NOH）。

3.4氧化態的變化

氧化態變化可誘導凝膠化，常見的氧化劑包括氧氣，高碘酸及其衍生物和過氧化氫。酶也可以通過氧化狀態的變化來誘導凝膠化。一個常見的例子是使用鄰苯二酚基團，該基團可以在氧化劑存在下形成反應性半醌和醌。隨後引發聚合反應，使兒茶酚官能化的聚合物適合於氧化介導的水凝膠交聯。

3.5酶添加

還有一個方法是引入可以催化水凝膠交聯反應的酶。例如，轉穀氨醯胺酶是天然催化賴氨酸ε-胺和穀氨醯胺側鏈醯胺之間異肽鍵形成的酶，可用在可溶性纖維蛋白原分子之間產生分子間交聯，該過程用於生成纖維蛋白原和纖維蛋白水凝膠。基於酶的方法可實現催化交聯，通常可在生理pH和溫度下以高底物特異性發生，而無需自由基引發劑或其他化學添加劑。

3.6電磁輻射

電磁輻射被廣泛用於引發水凝膠交聯。然而，在大多數情況下，這種方法需要的中間物質的存在，如光引發劑或等離子體納米顆粒。但是，光也可以用於直接觸發凝膠化。例如，Farahani等用2-（2-硝基苯基）丙氧羰基烷氧基胺對8臂PEG進行官能化，該烷氧基胺在紫外光（λ= 365 nm）照射下發生β消除反應，然後可以通過肟連接與苯甲醛封端的8臂PEG反應生成共價交聯的水凝膠。

4間接水凝膠觸發器

第二類水凝膠引發劑涉及間接機制（圖 1B），間接觸發機制分別是溫度、超聲波、電磁輻射。

溫度：脂質體特別適合作為熱響應性載體，因為它們表現出熱致相變。這些轉變與膜流動性和脂質堆積的變化有關，從而使溫度明杆的貨物釋放。

超聲波：超聲觸發的貨物釋放已被廣泛用於藥物輸送並且被用於引發水凝膠化。許多載體具有超聲響應性如脂質體，膠束，聚合物囊泡，微泡相移納米液滴。貨物釋放的機制包括使用高頻超聲誘導輕度的體溫過高或空化現象，以及使用低頻超聲刺激脂質體膜的瞬時孔形成。

電磁輻射：光觸發提供了遠程控制能力，紫外線和可見光已廣泛用於通過使用光引發劑分子來引發膠凝作用，光引發劑分子能夠吸收入射的輻射並形成可介導聚合反應的物質。常見的光引發劑通過Norrish I或II型反應生成自由基，包括芳族羰基化合物（通過均裂鍵裂解形成自由基），芳族酮（通過奪氫產生自由基），以及鎓鹽。自由基光聚合的一種替代方法是使用逐步增長的機制，例如硫醇-烯交聯。但高頻輻射（紫外線，短波可見光）對不透明物質（組織）的穿透深度有限。紅光或近紅外（NIR）光散射少，可克服該問題。另一種方法是使用NIR來引發等離子體納米結構溫度升高，以引發熱誘導的凝膠化，如金納米棒。這種方法通過更改雷射強度、輻照時間，或使用光掩模構造曝光來實現對水凝膠剛度的時空控制。

5應用

接著，作者詳細介紹六種水凝膠應用的最新進展。

5.1用於3D細胞培養的水凝膠

水凝膠可用於各種細胞培養，如生物過程研究或基於細胞的療法的開發。細胞可以在預製水凝膠上培養或封裝在水凝膠或微凝膠中。另外，水凝膠封裝還廣泛用於類器官的培養。與玻璃和塑料基板相比，水凝膠可以為細胞提供更緊密地複製生理學的生物、機械和地形環境。特別地，水凝膠封裝可以提供模擬細胞外基質的3D環境，從而支持或調節某些細胞行為。

5.2體內凝膠化

體內注射前驅物並凝膠化為材料輸送提供了微創方法，在許多組織工程，再生醫學和藥物輸送方法中非常熱門。一種方法是在注射前立即開始凝膠化過程，例如，在單桶或雙桶注射器注射過程中混合組分，在這種情況下，混合時的反應速度至關重要。如果凝膠化發生得太快，則注射器針頭可能會阻塞，反之，如果反應進行得太慢，則成分可能會在體內擴散並離開目標部位。另一種方法是在注射後引發液體前體溶液的凝膠化。此時，可選擇利用體溫（37°C）來熱觸發體內膠凝。但由於整個材料之間的熱傳輸現象，可能會導致膠凝不均勻，控制膠凝動力學仍然是一個挑戰。

體內凝膠化的另一種方法是使用剪切稀化凝膠，該凝膠在施加的剪切應力下會發生可逆的凝膠至液體轉變，即在注射過程中呈流體形式，在注射前後呈水凝膠狀態。

圖3體內凝膠化。A）（i）PEG水凝膠示意圖。在注射過程中將馬來醯亞胺官能化的PEG大分子單體和巰基封端的肽交聯劑混合，在體內形成水凝膠。（ii）胰島移植物的共聚焦螢光顯微鏡檢查。B）GelMA水凝膠的體內光交聯，用於角膜修復。C）將明膠溶液與矽酸鹽納米片混合後獲得的剪切稀化水凝膠。

5.3水凝膠圖案化

水凝膠中化學、物理和結構特徵的圖案化能夠在空間和/或時間上調節細胞-材料的界面。凝膠化之前，在前體溶液中構造聚合物或貨物組分。此外，基於掩模的光刻、單光子雷射掃描光刻和多光子雷射掃描光刻等技術已被用於預製高解析度、化學修飾的水凝膠。光電圖案化還可用於製造水凝膠剛度梯度。雙生化和剛度梯度控制水凝膠內的圖案化。

圖4水凝膠圖案化。A）在GelMA水凝膠中形成BMP-2梯度。將水凝膠進行光交聯，並在骨軟骨培養基中培養28天，以實現共包封的人間充質幹細胞的定向分化。B）使用聲波來捕獲pH響應型聚合物-二肽凝聚層微滴。C）基於蛋白質/ PEG的水凝膠中的光介導的剛度模式。

5.4基於水凝膠的生物製造

由於水凝膠的相行為和觸發機制使之合成方法非常靈活，它可用在生物製造。簡單的水凝膠生物製造方法是微成型，將水凝膠前體溶液沉積到模具中，進行交聯，然後脫模。水凝膠也用在許多不同的印刷方式，如液滴生物列印、光固化和雙光子聚合反應。在水凝膠生物油墨中加入了各種添加劑，可提供可印刷性或附加的結構功能特性。

圖5基於水凝膠的生物製造。A）體積生物列印技術，使用GelMA的光投射光交聯技術快速製造複雜的3D水凝膠結構。B）將稀疏剪切的水凝膠以液體形式擠出，並通過主客體相互作用而凝膠化，然後使用紫外光來介導HA主鏈上的甲基丙烯酸酯部分之間的交聯。C）基於Carbomer的油墨獲得的3D列印結構的代表性圖像。D）烯基官能化HA（NorHA）微凝膠通過真空過濾包裝成固體長絲，然後，將基於微凝膠的油墨用於在玻璃板上（無支撐）或自修復水凝膠（有支撐）內3D列印結構。

5.5細胞周膠凝

具有材料塗層的活細胞的功能化可為細胞提供保護性屏障，如生物電子設備用於組織工程的多細胞結構的定向組裝以及細胞的治療性遞送。第一種方法是可通過微滴微滴實現薄水凝膠層在細胞周圍的沉積。另一種方法是將能引發細胞周圍凝膠化的分子修飾到細胞膜表面。其他非酶促方法包括使用摻雜兔紅細胞胞質膜中的馬來醯亞胺官能化脂質，該脂質可與硫醇化PEG大分子單體或硫醇化藻酸鹽反應共價水凝膠塗層。與它類似的方法也被用來在各種哺乳動物細胞系的表面上形成DNA聚電解質水凝膠。也有人使用微流體裝置製造藻酸鹽預聚物和各種細胞的油包水乳液。這些細胞用CaCO3預塗納米顆粒，在將乙酸引入油相後溶解。游離鈣離子與藻酸鹽聚合物絡合，形成細胞周圍水凝膠殼。

圖6周細胞凝膠化和以納米顆粒為模板的納米凝膠製造。A）活細胞共聚焦螢光顯微鏡，在凝血酶包被的人間充質幹細胞（綠色）表面周圍形成了螢光標記的纖維蛋白纖維（紅色）。B）藻酸鹽-DNA聚合物網絡水凝膠可與聚賴氨酸在細胞表面周圍進一步交聯。C）利用環糊精和金剛烷基團之間的客體-客體絡合形成自組裝水凝膠。

6總結

在本綜述中，作者將內在觸發定義為通過直接改變基礎材料或反應動力學而引發膠凝的現象。內在觸發因素包括溫度或溶液pH值的變化，以及光或酶的輸入。作者還概述了水凝膠化的幾種間接觸發機制，從刺激響應載體中釋放出交聯物種的方法。這些方法的模塊化和綜合靈活性為設計新的觸發機制提供了更大的機會。作者預計新型水凝膠化機制的出現以及現有觸發機制的重新配置將為生物材料科學帶來新的機遇，並推動新的生物醫學應用的發展。這對於基於水凝膠的載體，植入物和設備的臨床翻譯尤為重要。許多水凝膠產品已進入市場，作為外科手術密封劑、傷口敷料、抗菌塗層、皮膚填充劑和軟骨修復基質。同時，用於膝骨關節炎的治療中測試的可注射的水凝膠製劑和軟骨缺損，抗生素加載的水凝膠塗層髖關節植入物，和組織標記的水凝膠用於放射治療。但是，仍然存在許多臨床挑戰，尤其是圍繞擴大規模的成本，符合良好生產流程以及複雜的監管和批准程序等方面。設計簡單且基於臨床已經使用的材料的水凝膠產品會受益於臨床患者。

參考文獻： https://doi.org/10.1002/adfm.202002759

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