在高通量測序（比如RNA-seq）中很重要的一塊就是檢測基因的表達量，基因表達量計算和差異表達分析是轉錄組數據分析的基礎。與q-PCR類似，轉錄組數據基因表達量的衡量也是採用相對定量的方法。那麼，到底該如何定量呢？
假設通過比對得到了A B C D 四個基因在 3個樣本中的 read counts 如下表，那麼，用比對到參考基因的Reads個數來衡量不同樣本基因的表達量可以嗎？可以認為樣本1中gene B比gene C表達量高嗎？或者gene B在樣本3中比樣本1表達量高嗎？
表1 不同基因比對得到的Read個數（示例數據來源網絡）
答案是當然不可以。原因主要有兩點：
① 基因長度的影響。
在同一個樣本中，基因越長，隨機打斷得到的片段就越多，該基因被測到的概率就越大，比對到該基因的 reads 就越多。
② 測序深度的影響。
不同樣本中，樣本的測序深度越高，同一基因被測到的次數越多，比對到該基因的 reads 就越多。
為了能進行不同樣本不同基因間的比較，就需要給這些數據同樣的「起跑線」，類似物理學的參照系。簡單來說也就是給 該基因的read counts 除以總 Reads 數和基因長度，消除測序深度和基因長度的影響。於是就有了常見的RPKM、FPKM、TPM 等標準化方法。
RPKM（Reads PerKilobase Million）:即Reads PerKilobase of exon model per Million mapped reads。
計算公式：
RPKM= total exon reads/ (mapped reads(Millions) * exon length(KB))
total exon reads：某個樣本mapping到特定基因的外顯子上的所有的reads；
mapped reads (Millions) :某個樣本的所有reads總和；
exon length(KB)：某個基因的長度（外顯子的長度的總和，以KB為單位）。
也就是一個樣本中一個基因的RPKM等於落在這個基因上的總的read數(total exon reads)與這個樣本的總read數(mapped reads (Millions))和基因長度(exon length(KB)) 的乘積的比值。
下面是依照公式計算上表中基因的RPKM值（注意：為了便於顯示，這裡將公式中的100萬改為100）：
表2 不同基因的RPKM值的計算結果（「M」為100時）
FPKM（Fragments PerKilobase Million）: Fragments Per Kilobase of exon modelper Million mapped fragments
FPKM和RPKM的計算方法基本一致，只不過把reads換成了Fragments。對於單末端測序數據，由於Cufflinks軟體計算的時候是將一個read當做一個fragment來算的，故而FPKM等同於RPKM.
對於雙末端測序，如果一對paired-read都比對上了，那麼這一對paired-read稱之為一個fragment；而如果只有一個比對上了，另外一個沒有比對上，那麼就將這個比對上的read稱為一個fragment。而計算RPKM時，一對paired-read會當成兩個read分別計算。
關於Fragments和Reads的區別見下圖：
TPM（Transcripts PerKilobase Million）：Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads
而TPM 的計算公式：
TPMi=(Ni/Li)*1000000/sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)
Ni：mapping到基因i上的read數； Li：基因i的外顯子長度的總和
一個樣本中某基因的TPM值的計算方法：先對每個基因的read數用基因的長度進行校正，之後再用校正後的這個基因read數(Ni/Li)與校正後的這個樣本的所有read數（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商。
下面是依照公式計算上表中基因的TPM值（注意：為了便於顯示，同上，將公式中的100萬改為100）：
表3 不同基因的TPM值的計算結果（「M」為100時）
不管是計算FPKM、RPKM，還是計算TPM，我們需要一個Read Count的數據矩陣（行為基因，列為樣本）。在計算TPM是先對基因長度進行標準化，之後再對列進行標準化。
這樣使得最終的TPM矩陣的每列總和都相同（等於1000000），也就是說每個樣本中的TPM的總和都是一樣的。理論上，這使得我們更容易比較不同樣本中所佔同一基因的read數的比例。
更多關於RPKM, FPKM, TPM的優缺點以及基因表達量計算的優化方法，周老師在《基因表達量計算與差異表達分析》教學視頻有詳細的講解，大家可通過點擊 閱讀原文 或在基迪奧生物公眾號菜單欄的 在線課堂 觀看。
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拓展閱讀
《RPKM與TPM ，you choose who？》
《RPKM值是怎麼計算的？》
《RNAseq看表達量高低是看哪個值？》
《RNA-seq沒有生物學重複 被審稿人argue怎麼辦？》