FPKM和TPM

FPKM ：Fragment per kilo base per million mapped reads（每千鹼基片段每百萬映射讀取的 reads 數）

TPM : Transcripts per million （每百萬映射讀取的 Transcripts）

圖 1

 

圖 2

計算 FPKM 的方法：第一步， 計算總reads 數；第二步，標準化總的reads 數；第三步，將總的reads 數除以基因長度，計算得到FPKM 值。計算 TPM 的方法，第一步，將總的reads 數除以基因長度 ；第二步，計算總reads 數；第三步，標準化總的reads 數，計算得到TPM 值。

 

圖 3

FPKM 和 TPM 相比，對於 FPKM 來說，每個重複的總reads 數都不同。對於 TPM 來說，每個重複的 TPM 值是一樣的。因此在 RNA-Seq 中研究基因的轉錄水平，更推薦使用 TPM 值。

 

圖 4

在圖 4 中，樣本A相對於樣本B，每個基因的表達似乎都增加了一倍，但這是樣本A的測序深度增加了一倍的結果。

 

 

圖 5

在圖 5 中，基因X和基因Y有相似的表達水平，但是映射到基因X的讀取序列數量會比映射到基因Y的讀取序列數量多很多，因為基因X更長。

 

圖 6

在圖 6 中，RNA組成，樣本間表達差異較大的基因，樣本間表達基因數量的差異，或汙染的存在，都可能使某些類型的歸一化方法出現偏差。

 

圖 7 Tissue type

 

 

圖 8 Library preparation

使用人類血液和結腸組織樣本，評估臨床 RNA 測序中 polyA+ 選擇和 rRNA 缺失的基因定量（Zhao et all.2018）。使用兩種方案製備和測序相同的樣本。將所有原始測序 reads 存入 NCBI 序列。對於血液和結直腸樣本，polyA+ 選擇最豐富的類別是蛋白質編碼基因，而在 rRNA 消耗協議中是小 rRNA 。由於不同的樣本製備方案，TPM 值不能直接比較，儘管他們是從相同樣本中得到的。對於編碼蛋白質的基因，在 polyA+ 的選擇中 TPM 值往往較高，而對於小 rRNA 則相反。

參考文獻：

1.Zhao S, Ye Z, Stanton R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols[J]. RNA, 2020: rna. 074922.120.

2.Statquest: RPKM, FPKM and TPM, clearly explained