哈佛大學的Brian Saar，Gary Holtom和謝曉亮教授（從左至右）發展了非線性顯微成像技術和應用。
一個富含蛋白質的毛髮及其周圍的富含脂肪的皮脂腺。該圖像是通過受激拉曼散射方法採集的，綠色為脂肪，藍色為蛋白質。
兩年前，Annika Enejder在她關於線蟲的脂肪貯存研究中，遇到一個令人困惑的結果。螢光顯微圖像非常清晰地表明，在用他汀類藥物處理這些蛔蟲時，來自脂肪粒的信號將降低。他汀類藥物是一類被廣泛用於降低膽固醇的藥物。然而，在同時進行的另一種顯微實驗中，直接觀察脂肪顆粒卻看不到這樣的變化。實際上，相干反斯託克斯拉曼散射（CARS）顯微技術能夠識別出脂肪顆粒，而螢光顯微技術做不到。
其實是這麼回事，用常用的Nile red螢光染料飼餵的線蟲把這種染料當作毒物處理了：染料被隔離到脂肪粒周圍的腸類溶酶體顆粒中，而不是脂肪粒中。實際上，這種染料還在別的方面具有誤導性：他汀類本身似乎會影響它的染色或者螢光。「在使用螢光基團的時候，有很多假象要考慮到。」 來自位於瑞典查爾姆斯理工大學的Enejder說。
沒人能夠否定螢光探針和分子染色在細胞內行為探測上的實力，但是這種標記辦法仍然有諸多問題。如何標記是一個問題，尤其是對整個有機體而言。有些標記只能在已死亡的細胞內有作用；其他的標記標記方法則會損傷細胞，或者幹擾所研究的生物過程。非標記的顯微技術提供了一種能夠大幅度降低人為幹擾的活體觀察技術。雖然有些技術仍然依賴內源性螢光基團，不過它們基本上可以摒棄螢光技術，也就避免遇到光漂白這個常見問題。這些新技術探測的是光在通過生物樣品時被吸收或者改變時發生的微小變化，而不是探測被激發螢光基團的光子。這種辦法依賴在高光功率密度下觀察到的非線性光學過程。一言以蔽之，雷射脈衝可以被用來「看」化學組成：脂質裡面的C-H鍵，蛋白質裡的醯胺鍵，還原態或者氧化態的生物分子，膠凝蛋白或者微管裡面有規律地重複的單元。
當然，這樣的技術也自有其局限性：與螢光標記能夠識別單分子相比，非標記技術的靈敏度和特異性都要弱一些。只有特別常見的基團才不會淹沒在一些豐富樣品產生的信號當中。「這種技術的好處是，你不需要任何標記，你只需要去成像就行了」，荷蘭癌症研究所（Netherlands Cancer Institute）的生物物理學家Kees Jalink解釋道，「但是不好的地方是，信號太弱了，你需要大量能量來照射一個細胞，而可能僅僅得到一些粗枝大葉的細節。
非線性的眾多模式
除CARS以外，其他可用的非標記手段包括雙光子吸收，二次諧波產生（SHG）以及受激拉曼散射，每一種都有自己的配置需求和優勢。然而，這些手段並沒有在生物學家中間閃電般地傳播開。昂貴的雷射需要被耦合進顯微鏡；光的短脈衝需要精確的瞄準、調整和整形；探測器必須被優化，從而能夠拾取信號，捨去背景。「組裝這些儀器需要豐富的專業經驗；這些儀器都要求苛刻」，供職於加拿大不列顛哥倫• 比亞大學化學與工程系的Robin F.B. Turner這樣評價。而僅僅搭建儀器是不夠的。「你得根據每天的情況重新校準」，Turner補充道。
Turner說，他有充分的理由跟蹤這些技術：他想知道幹細胞在分化成其它細胞的時候，其中的組分如何變化，而且再也沒有比這個更好的辦法能夠研究這個問題了。「我們之所以選擇拉曼和CARS，是因為它們能夠做這種研究而不損傷細胞」，他說。其它研究手段都會毀損細胞，得到的僅僅是在某個時間點上的一個瞬間狀況；這樣的數據對於包含自發分裂細胞的異質性細胞培養並不是十分有用，Turner補充道，「我們想追蹤細胞的生長」。
同樣的優勢在組織層次的研究上也很突出。比如，哈佛大學的Gary Ruvkun通過對線蟲誘導RNA幹擾篩選來研究上千個基因在脂質生成中的角色，同時通過一種叫做受激拉曼散射（SRS）的技術來監視這些結果。
Ruvkun的合作者謝曉亮教授也來自哈佛大學。大約十年前，謝曉亮因為發布了CARS顯微術而引發了巨大轟動。這種技術通過一種叫做自發拉曼散射的現象來增強信號。在自發拉曼散射中，樣品內的化學鍵能夠改變通過其中的光的波長。更早使用的拉曼散射顯微術要求的雷射功率很高，而且有時候需要曝光時間長達一天。謝曉亮和他的同事證明，CARS可以用於活細胞研究。通過使用兩束雷射，它們的頻率差等於需要成像化學鍵的振動頻率，細胞產生的微弱的拉曼信號能夠被不斷放大。「它的靈敏度比自發拉曼散射的靈敏度高了好幾個數量級」，謝曉亮說。但是CARS也有缺陷。在同一時間裡，它只集中在很寬的拉曼譜中很短的一段，限制了所能採集的信號的數量；同時還帶來了很高的背景信號。從實用的角度講，這些限制意味著如果要應用CARS技術，大部分時間要基於對脂質的探測，因為碳氫鍵的大量富集能夠產生很強的特徵信號。
謝曉亮的興趣已經轉移到了SRS，這是他和他的組員閔瑋、Christian Freudiger共同發展出來的技術，相關論文於2008年發表。「在CARS裡面，信號峰位發生了移動，」謝曉亮解釋道，「這意味這我們不能使用現有的、數量巨大的拉曼譜數據進行化學鑑定。」他還講到，與此相比，SRS能夠通過對雷射異常迅速和精確地調製來去除背景噪音。這樣一來，不僅能夠得到與傳統拉曼光譜一樣的譜圖，而且信號強度高了幾個數量級，採集時間也遠低於未經放大的拉曼信號。謝曉亮說，更妙的是，SRS產生的信號與振動化學鍵的數量是線性關係，這使得SRS能夠進行定量分析。SRS技術可以應用於實時觀測：比如在在藥物和化妝品研究領域，觀察維生素A酸是如何被皮膚吸收的。SRS技術還可以用於觀測酸或者酶是如何從植物細胞壁表面去除木質素，從而提高生物燃料的生產效率。
謝曉亮最早是通過與Pfizer以及哈佛研究者的合作研究獲得對該技術的原理的證據的。謝曉亮甚至預言，SRS技術有一天會取代CARS技術，然而其他研究人員對此有所保留。SRS需要對多個光源的信號進行混合和解讀，而譜的疊加也會使去卷積變得困難。Turner說，他曾經嘗試用SRS觀察溶液中的核酸，最後還是決定繼續使用原來的老技術。利用那些老技術，就可以從細胞的DNA裡分辨出RNA。他說，儘管拉曼顯微鏡可能慢一些，「但是應用SRS技術來擴展我們的知識也挺費勁的，跟使用傳統拉曼技術差不多。」
採購與分享
謝曉亮預計，一旦SRS被植入商用系統，很快就會傳播開來，他認為早在今年底之前就會取得這樣的進展；據報導，蔡司和徠卡已經於去年獲得這項技術的授權。然而，就像螢光顯微鏡的前車之鑑，技術的傳播可能相當緩慢。第一臺商用多光子顯微鏡於1996年發布；而2003年的一項調查發現，66%使用多光子顯微鏡的生物學研究仍然使用定製系統。現在，商用多光子顯微鏡則相當普遍。
2009年10月，適逢謝曉亮的文章發表十年，奧林巴斯宣布要提供可以安裝在多光子顯微鏡系統上的femtoCARS模塊。2010年1月，Newport公司展示了可以附接到雷射和多光子顯微鏡上的波長擴展單元，用以支持CARS、SHG以及其他成像方式。據悉，徠卡也將於下半年推出自己的產品。奧林巴斯的產品經理YiWei（Kevin）Jia宣稱，早在飛秒femtoCARS模塊發布之前，他已經在幫助各個研究組著手搭建CARS系統；而這個用來探測脂肪的模塊能夠讓起步更加容易。他說，如果CARS的商業化產品推廣像多光子顯微鏡一樣，那麼銷售則能在數年之內有一個大的飛躍。不過目前大多數應用CARS顯微技術的主要還是物理實驗室，而且使用的是自己搭建的系統。
不過，這些研究人員已經開始和生物學家們合作。在普渡大學，生物醫學工程教授程繼新利用CARS在細胞中迅速地尋找脂肪體，然後使用同樣的光源，切換到共聚焦拉曼來做同一個區域更詳細的化學成分分析。新近關於人類前列腺腫瘤細胞的研究發現，先前被認為由脂肪組成的區域，實際上是被氧化的脂肪酸。下一步是考察這種脂肪酸會否可以用於標記前列腺癌的嚴重性。在別的項目中，程繼新已經發展了一個平臺，可自動收集CARS信號的來觀測脂肪，還利用一種叫做和頻產生的技術看到特定的蛋白纖維。有了這種技術，程繼新及其合作者們可以研究富脂免疫細胞如何將自己嵌入到血管壁的膠原蛋白基質中去的——這類觀測可以揭示動脈粥樣硬化中的血塊是如何形成的。程繼新和他的同事還獨立監測了多發性硬化症的老鼠模型中的神經元髓鞘，並且精確地指出是軸突的某個地方出現了損傷。他說，「以前在活體組織中對髓鞘的監測是沒有辦法達到單細胞水平的。」
Jalink說，髓鞘因為緊密堆積了大量脂質，特別適合用CARS成像。非標記顯微技術在其他方面的應用則可能沒那麼容易。他說經常使用雷射器的研究人員很可能會想辦法採用這樣的技術，他補充道，「技術上講，這是完全可行的，但是如果我能用另一種方式來獲得同樣的信息，我為什麼要採用這個多少有些複雜而且昂貴的技術呢？」
技術一旦發展起來，研究人員就能把它們應用到新的方面。哥倫比亞大學的Rafael Yuste利用光學手段來測量神經電位。二次諧波發生（SHG）成像技術依賴於排列非常規則的分子產生的超散射光。這些分子具有極強的誘導偶極矩，或者特定的電荷分布。Yuste對位於神經元細胞膜這類分子非常感興趣——因為電場貫穿其中。由於二次諧波信號和電場強度直接成比例，因而可以自動獲得電壓信號。
問題在於，能夠很好地實現這一目標的分子非常少。為了達到好的效果，Yuste說，「你需要非常仔細地去掃描全譜，來尋找潛在的內源性二次諧波發色基團。」他說，發展這種技術需要依賴學科交叉，需要研究人員在他們研究領域的邊緣工作。但是在現實中，這種工作往往在研究者們自己的系裡得不到足夠的資金和支持，這也是為什麼能夠實現這一目標的分子資源較少的原因。
Enejder等人相信，學科交叉能夠幫助人們解決大量只能由非標記的非線性顯微技術來觀測的問題。雖然Enejder的背景的是物理學，她還是轉到了生物系。因為在那裡可以更容易的了解生物學家們在成像上到底遇到了什麼問題，非線性光學如何才能幫得上忙。她說，那些把自己的眼光牢牢地局限在物理系內部的人可以繼續優化技術，但是他們或許不了解生物學家到底希望看到什麼：「我就完全沒有這個問題。在我眼裡，應用隨處可見。」
當這樣的交流變得日益重要的時候，對新實驗的大膽嘗試也變得重要起來——而這些實驗與物理學家們以往的經驗可能截然不同。在一項旨在製造彈性血管的生物工程項目中，Enejder和同事們想要監測植入纖維素基質的肌肉細胞的生長。與CARS一起，Enedjer和同事們利用SHG觀察了植入的細胞。他們很高興地發現，自己可以監測到被植入細胞是如何與纖維素網進行接觸，開始生成膠原蛋白纖維的。在組織工程研究中，這種方法可以大大幫助確定最優參數。儘管紙張中的植物纖維素SHG成像看不到，但是細菌分泌的植物纖維素確實擁有一種有規律的模式，能夠產生SHG信號，Enejder解釋說，「僅僅依賴別人文章裡說的哪些可以觀測是不行的，你得自己去試才行。」（陳濤、何姣/編譯報導）
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