尿酸酶活性測定方法_中國教育裝備採購網

蛋白含量測定採用考馬斯亮藍檢測法(Bradford檢測法)和A280光吸收法，具體操作按文獻[13]進行。

 

a)        硼酸緩衝液儲備液(20 mmol/L EDTA，0.02% Triton-X100，pH8.5 1 mol/L硼酸緩衝液)

稱取硼酸6.185 g，硼砂9.535 g，EDTA 1.169 g，10％ Triton X-100 400 μL，ddH2O定容到200 mL。

b)        尿酸稀釋液(1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X-100，pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液)

取硼酸緩衝液儲備液8 mL加入ddH2O 152 mL，檢測pH=8.5。

c)        尿酸酶工作溶液儲備液(0.01% 尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X-100，pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液，用棕色瓶冷凍保存)

準確稱取10 mg尿酸溶解於稀釋液中，並準確定容至100 mL，此溶液作為儲備液保準於4℃，測定活性時用相同緩衝液稀釋10倍使用。

d)        尿酸酶酶活測定工作液(0.001%尿酸，1 mmol/L EDTA，0.001% Triton X-100，pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液，用棕色瓶冷凍保存)

將尿酸酶工作溶液儲備液稀釋10倍即得。

 

1.2.2.2      酶活性測定過程[14]

先加入2 mL尿酸溶液和0.5 mL ddH2O於試管中，於40℃水浴中保溫5 min。加入0.5 mL適當稀釋的酶液到試管中，準確反應5 min後，加入0.2 mL 20% KOH終止反應。根據尿酸於290 nm處的特徵吸收，測定尿酸被尿酸酶氧化生成尿囊素後，剩餘尿酸在290 nm處吸光值。空白管則先加入KOH，再加入酶液，立即混勻，讀取290 nm處吸光值。

 

1.2.2.3      酶活力單位的定義[14]

在40℃、pH8.5下，每分鐘催化1 μmol 尿酸分解所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

酶活力(U/mg)=(U/mL)×1/C

 

Vt：總體積(3.2 mL)，Vs：樣品體積(0.5 mL)，t：反應時間(5 min)，12.04：測試條件下的尿酸摩爾消光係數， 1.0：比色皿光徑(cm)，df：稀釋倍數，C：酶濃度(mg/mL)。

 

1.2.2.4      尿酸濃度標準曲線

將尿酸酶工作液儲備液用pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液稀釋至尿酸濃度為0.06 mmol/L，按表1.2加入0.06 mmol/L尿酸溶液、pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液，每組測定樣分別作3個平行測試對照。

表1.1：測定尿酸濃度標準曲線方法

Table 1.1: Standard curve of uric acid

編號

0.06 mmol/L尿酸(μL)

pH8.5 50 mmol/L硼酸緩衝液(μL)

尿酸終濃度(mmol/L)

0

0

200

0

1

40

160

0.012

2

60

140

0.018

3

80

120

0.024

4

100

100

0.030

5

120

80

0.036

6

140

60

0.042

7

160

40

0.048

8

180

20

0.054

9

200

0

0.060

各管搖勻後靜置約1 min，以不加尿酸的空白管(管號0)調零，用分光光度計測定290 nm處的光吸收值。以尿酸濃度對290 nm處的光吸收值作圖，得到尿酸濃度標準曲線(圖1.1)。

 

 

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