【科研方法15】一文帶你看懂穩態/瞬態螢光光譜原理與應用

1、原理

在吸收紫外和可見電磁輻射的過程中，分子受激躍遷至激發電子態，大多數分子將通過與其它分子的碰撞以熱的方式散發掉這部分能量，部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長不同於所吸收輻射的波長。後一種過程稱作光致發光。

分子發光包括螢光、磷光、化學發光、生物發光和散射光譜等。基於化合物的螢光測量而建立起來的分析方法稱為分子螢光光譜法。

被測的螢光物質在激發光照射下所發出的螢光，經過單色器變成單色螢光後照射於光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀。一個激發，一個發射，採用雙單色器系統，可分別測量激發光譜和螢光光譜。目前國內外螢光光譜儀示意圖如圖一：

圖一 螢光光譜儀原理示意

2、分類

螢光光譜儀是測定材料發光性能的基本設備。 通用螢光光譜儀大致可分為3種：
(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可見波段的穩態光譜儀。 
(2) 擴展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見-近紅外穩態光譜儀。 
(3) 綜合型：覆蓋上述兩個波段，同時可測瞬態光譜的光譜儀。

3、主要部件

光源：提供不同波長的激發光

單色器：激發單色器將光源發出的複色光變成單色光，發射單色器將發出的螢光與雜散光分離，防止雜散光對螢光測定產生幹擾。

狹縫：控制光通量

檢測器：光電倍增管

樣品池：四面透明正方形石英池，長1cm，寬1cm

4、主要用途

（1）螢光激發光譜和螢光發射光譜 
（2）同步螢光（波長和能量）掃描光譜
（3）3D（Ex Em Intensity) 
（4）Time Base和CWA(固定波長單點測量）
（5）螢光壽命測量，包括壽命分辨及時間分辨
（6）計算機採集光譜數據和處理數據（Datamax和Gram32)

螢光光譜的應用領域

1、螢光與磷光現象

2、螢光與磷光產生原理

螢光：第一激發單重態的最低振動能級→基態

磷光：第一激發三重態的最低振動能級→基態

3、激發與發射光譜

任何螢光化合物都具有兩個特徵光譜：激發光譜和發射光譜。

激發光譜反映了某一固定的發射波長下所測量的螢光強度對激發波長的依賴關係；

發射光譜反映了某一固定激發波長下所測量的螢光的波長分布。

激發光譜和熒(磷)光光譜

螢光光譜能夠提供激發譜、發射譜、峰位、峰強度、量子產率、螢光壽命、螢光偏振度等信息，螢光分析定性和定量的基礎。

螢光光譜的特點：

（1）Stokes位移。激發光譜與發射光譜之間有波長差，發射光譜波長比激發光譜波長長；

（2）發射光譜的形狀與激發波長無關；

（3）鏡像規則，螢光發射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關係。

4、螢光壽命

螢光物質具有兩個重要的發光參數：螢光壽命和螢光量子產率。

螢光壽命（τ）是指當激發停止後，分子的螢光強度降到激發時最大強度的1/e所需的時間，它表示粒子在激發態存在的平均時間，通常稱為激發態的螢光壽命。與穩態螢光提供一個平均信號不同，螢光壽命提供的是激發態分子的信息，前者可以告訴你事情發生了，而後者可以告訴你為什麼發生。

螢光壽命示意圖

螢光壽命與物質所處微環境的極性、黏度等有關，可以通過螢光壽命分析直接了解所研究體系發生的變化。螢光現象多發生在納秒級，這正好是分子運動所發生的的時間尺度，因此利用螢光技術可以「看」到許多複雜的分子間作用過程，例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態高分子的構象重排、蛋白質高級結構的變化等。螢光壽命分析在光伏、法醫分析、生物分子、納米結構、量子點、光敏作用、鑭系元素、光動力治療等領域均有應用。

螢光壽命的測定技術有時間分辨單光計數技術(TCSPC)、相調法、閃頻法。其中TCSPC具有靈敏度高、測定結果準確、系統誤差小的優點，是目前最流行的的螢光壽命測定方法。

5、螢光量子產率

螢光量子產率（φf）是螢光物質另一個基本參數，它表示物質發生螢光的能力，數值在0~1之間。螢光量子效率是螢光輻射與其他輻射和非輻射躍遷競爭的結果。

式中， kf為螢光發射過程的速率常數， ∑ki為其他有關過程的速率常數總和。一般來說， kf主要決定於化學結構，而 ∑ki主要決定於化學環境，同時也與化學結構有關。

6、分子結構與螢光

並不是所有的分子都能產生螢光，分子產生螢光必須具有：合適的結構和一定的螢光量子產率。螢光產生與分子結構的關係如下：

（1）電子躍遷類型。大多數螢光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發，然後經過振動弛豫或其他非輻射躍遷，在發生π*→π或π*→n躍遷而產生螢光，其中π*→π螢光效率最高。

（2）共軛效應。含有π*→π躍遷能級的芳香族化合物的螢光最常見且最強。具有較大共軛體系或脂環羰基結構的脂肪族化合物也可能產生螢光。

（3）取代基效應。苯環上有吸電子基常常會妨礙螢光的產生，而給電子基會使螢光增強。

（4）平面剛性結構。具有平面剛性結構的有機分子大多具有強烈螢光，因為該結構可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用。

螢光分析就是基於物質的光致發光現象而產生的螢光的特性及其強度進行物質的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表徵技術來研究體系的物理、化學性質及其變化情況，例如生物大分子構象及性質的研究。

螢光光譜適用於固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。

螢光分析的優點：（1）靈敏度高；（2）選擇性強；（3）試樣量少、方法簡單；（4）提供較多的物理參數。但是也存在應用範圍不夠廣泛、對環境敏感（幹擾因素多）等缺點。

1、定性分析

不同結構螢光化合物都有特徵的激發光譜和發射光譜，因此可以將螢光物質的激發光譜與發射光譜的形狀、峰位與標準溶液的光譜圖進行比較，從而達到定性分析的目的。

2、定量分析

在低濃度時，溶液的螢光強度與螢光物質的濃度成正比：F=Kc。其中，F為螢光強度，c為螢光物質濃度，K為比例係數。這就是螢光光譜定量分析的依據。

上述關係不適用於螢光物質濃度過高時，螢光物質濃度過高，其螢光強度反而降低。原因有：

（1）內濾效應。一是，當溶液濃度過高時，溶液中雜質對入射光的吸收作用增大，相當於降低了激發光的強度。二是，濃度過高時，入射光被液池前部的螢光物質強烈吸收，處於液池中、後部的螢光物質，則因受到入射光大大減弱而使螢光強度大大降低；而儀器的探測窗口通常對準液池中部，從而導致檢測到的螢光強度大大降低。

（2）相互作用。較高濃度溶液中，可發生溶質間的相互作用，產生螢光物質的激發態分子與其基態分子的二聚物或其他溶質分子的複合物，從而導致螢光光譜的改變和/或螢光強度下降。當濃度更大時，甚至會形成螢光物質的基態分子聚集體，導致螢光強度更嚴重下降。

（3）自淬滅。螢光物質的發射光譜與其吸收光譜呈現重疊，便可能發生所發射的螢光被部分再吸收的現象，導致螢光強度下降。溶液濃度增大時會促使再吸收現象加劇。

3、影響螢光強度的外部因素

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