一、技術原理
1. 標記原理
活體螢光成像技術主要有三種標記方法。
① 螢光蛋白標記:螢光蛋白適用於標記細胞、病毒、基因等,通常使用的是GFP、EGFP、RFP(DsRed)等;
② 螢光染料標記:螢光染料標記和體外標記方法相同,常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7,可以標記抗體、多肽、小分子藥物等;
③ 量子點標記:量子點(quantum dot)是一種能發射螢光的半導體納米微晶體,是由數百到數萬個原子組成的原子簇,尺寸在100nm以下,外觀恰似一極小的點狀物。量子點作為一類新型的螢光標記材料,其在長時間生命活動監測及活體示蹤方面具有獨特的應用優勢。與傳統的有機螢光試劑相比較,量子點螢光比有機螢光染料的發射光強的20倍,穩定性強100倍以上,具有螢光發光光譜較窄、量子產率高、不易漂白、激發光譜寬、顏色可調,並且光化學穩定性高,不易分解等諸多優點。主要應用在活細胞實時動態螢光觀察與成像,可以在長達數天內進行細胞的分化和世系觀察, 以及細胞間、細胞內及細胞器間的各種相互作用的原位實時動態示蹤。不但如此,量子點還可以標記在其他需要研究的物質上,如藥物、特定的生物分子等,示蹤其活動及作用。
2. 光學原理
螢光發光是通過激發光激發螢光基團到達高能量狀態,而後產生發射光。同生物發光在動物體內的穿透性相似,紅光的穿透性在小動物體內比藍綠光的穿透性要好得多,隨著發光信號在體內深度的增加,波長越接近900nm的光線穿透能力越強,同時可消減背景噪音的幹擾,近紅外螢光為觀測生理指標的最佳選擇。在實驗條件允許的條件下,應儘量選擇發射波長較長的螢光蛋白或染料。
二、活體動物螢光成像技術應用領域
1. 腫瘤學
活體螢光成像技術能夠無創傷定量檢測小鼠的皮下瘤模型。相對於生物發光成像技術,活體螢光成像技術檢測時間較快,只需要不到1s的時間,同時不需要注射底物,節約了檢測成本。但是需要選擇近紅外螢光檢測深部組織,目前此波段的螢光蛋白種類有限,精確定量較難。
① GFP標記的肺腫瘤模型(H-460-GFP)
H-460-GFP是一個綠色螢光蛋白表達細胞系,它起源於H-460肺小細胞肺癌,穩定轉染了綠色螢光蛋白基因,並由SV-40啟動子起始基因的表達。
通過H-460-GFP皮下腫瘤模型,建立小鼠肺癌的實驗模型,可用來進行有關抗癌藥物的篩選(圖1)。可用於測量皮下腫瘤的生長和監測對潛在化學治療藥物的反應。
圖1 左圖是接種後1w螢光成像,右圖是3w螢光成像
② 量子點標記細胞系
通過量子點可以標記腫瘤細胞,用量子點Qtracker® 705對MDA-MB-231乳腺癌細胞進行標記,皮下接種後動態觀察其生長以及變化(圖2)。激發光波長625nm ,散射光波長680nm。
圖2 量子點標記腫瘤細胞不同時間螢光成像
2. 抗體
分子探針的一端聯有能夠和生物體內特異靶點結合的分子結構(如肽類、酶的底物、配體等),另一端則是螢光染料。通過Cy5.5標記的抗體的體內代謝實驗,可見肝、腎等處的分布(圖3)。
圖3 Cy5.5標記的抗體的體內代謝實驗
3. 藥學研究
螢光成像在藥物製劑學研究,尤其是藥物靶向性研究,藥物載體研究中有巨大優勢。有關專家正在設計用合適的螢光染料標記小分子藥物,觀察藥物在動物體內的特異性分布和代謝情況,尤其是中藥研究方面。
應用透射儀從樣本底部激發光源,可以提高活體螢光成像的靈敏度和檢測的深度。圖4是應用NIR螢光染料標記的β澱粉酶來觀察治療Alzheimer病的藥物的治療效果,曝光時間僅為200 ms,激發波長680nm,散射光波長720nm。
圖4 NIR標記的β澱粉酶成像
4. 組織工程
通過發展EGFP基因表達的細胞系無創傷的評價組織工程的構建。通過EGFP標記的組織工程細胞移植到小鼠體內特製的支架上,觀察該細胞的生長和變化,從而判斷組織工程的成敗與否。