關於細胞標記和螢光素酶的特性
1. 螢光素酶的發光是否需要激發光？ 螢光素酶的發光是生物發光，不需要激發光，但需要底物螢光素(Luciferin)。
2. 螢光素酶的發光特性如何？ 螢光素腹腔注射老鼠後約一分鐘後表達螢光素酶的細胞開始發光，十分鐘後強度達到穩定的最高點。在最高點持續約20-30 分鐘後開始衰減，約三小時後螢光素排除，發光全部消失。最好的檢測時間是在注射後15到35分鐘之間
3. 底物螢光素(Luciferin)是如何進入小鼠體內的？需要多少？ 螢光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。 大部分發表的文章中，螢光素的濃度是150mg/kg (見下圖)。20克的小鼠需要3毫克的螢光素，價錢約兩到三美元。常用方法是腹腔注射，擴散較慢，開始發光慢，持續發光長。若進行螢光素靜脈注射，擴散快，開始發光快，但發光持續時間很短。
4. 螢光素的體內代謝過程 不同品牌的螢光素底物的代謝過程不太一樣， 使用前最好做一些體外試驗，做一個標準曲線。下面是我們試驗的一些例子：
5. 兩次觀察間隔時間最短為多長時間？ 觀察時間的間隔沒有最短限制， 只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。
6. 螢光素酶基因，螢光素酶，螢光素底物有多大？可以透過血腦屏障嗎？ 螢光素酶有554個胺基酸，約50KD。螢光素酶的底物螢光素，約280道爾頓。螢光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。
7. 做體內實驗的luciferin 與體外實驗的是不是一樣，如何購買？最小包裝多大？ 體內生物發光是用的是D-Luciferin，我們提供1g或小到100mg 的包裝。
8. 如何保證螢光素酶(Luciferase)的穩定性？ 螢光素酶基因是插到細胞染色體內的，當細胞分裂、轉移、分化時, 螢光酶也會得到持續穩定的表達。螢光素酶的半衰期約三個小時，所以只有活細胞才能夠持續表達螢光素酶。
9. 標記的腫瘤接種以後，會發生luciferase的丟失嗎？ 沒有正式的報導丟失Luciferase的情況。丟失的可能性及量非常小，不會影響實驗結果。一些實驗報導的結果中，標記的細胞在動物體內存活幾年的時間還可以持續發光，說明Luciferase基因的標記非常穩定。
10. 在in vitro 的細胞培養中，為什麼要經常用抗生素篩選？ 螢光素酶基因標記的細胞株是經過單克隆篩選培養過的穩定的細胞株。體外培養過程中，不篩選也可以，只要時間不是很長， 接種代數不要很多。到目前為止，還沒有發現基因丟失的情況。但若接種的代數過多，建議用藥物篩選一段時間或從原始的細胞株培養以保證細胞發光的強度。
11. 可以用腫瘤塊而不是細胞接種嗎？ 可以先用標記的細胞在皮下接種，然後從皮下取出腫瘤塊進行原位接種。
12. 螢光素酶基因在標記的細胞中有多少個COPY，在什麼位點？ 細胞中的copy數目，和標記的位點對於實驗沒有任何影響，後來的實驗中基本不進行那樣的研究。
13. 標記細胞與標記基因所用的啟動子有何不同？ 標記細胞一般用在細胞內能穩定表達的啟動子, 顯示細胞的數目。標記基因一般用此基因的啟動子，與此基因平行表達，顯示此基因的表達數目。
14. 螢光素酶的表達高低與所用啟動子的活性有關嗎？ 有關，啟動子的活性高，則螢光素酶的表達高，啟動子的活性低，則螢光素酶的表達低。還可以根據此原理，用特定的啟動子驅動螢光素酶，來觀察該啟動子在活體動物體內的特定條件下的表達情況，並檢測影響該啟動子表達的因素。這正體現了應用活體成像技術研究的優勢。
15. 有幾種常用的螢光素酶？特性如何？ 常用的有兩種螢光素酶，Luciferase 和 Renilla螢光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，後者的底物是coelentarizine 。二者的發光顏色不一樣，前者所發的光波長在540-600nm，後者所發的光波長在460-540nm左右。前者所發的光更容易透過組織，後者在體內的代謝比前者快。大部分的發表文章通常使用前者用作報告基因， 也有一些文章使用兩者進行雙標記。
16. 組織切片可以觀察到生物發光嗎？ 可以，但螢光酶的體外活性保持時間比較短， 約幾十分鐘。有相關的文獻。
17. 標記好的細胞的螢光素酶是隨機還是插入固定的位點？ 插入的位點是隨機的，但每一個構建好的細胞株我們都做過詳細的分析，與其母細胞株進行詳細的比較，證明螢光素酶的插入對細胞的各種特性(包括生長周期，成瘤性等)沒有造成影響。
18. 能標記病毒嗎？能標記病毒的某一個基因嗎？ 可以標記病毒，由於病毒在核酸結構上的特性，每個病毒標記的方法不一樣，具體的可以參見有關文獻。還沒有看到標記病毒某一個基因的報導， 但理論上講，將螢光素酶基因與想標記的基因平行表達，可以標記任何基因。
19. 細菌標記問題 對於細菌標記，一般利用發光酶基因操縱子luxABCDE控制的編碼螢光素酶的基因和編碼螢光素酶底物合成酶的基因組成。 利用這種辦法進行標記的細菌會持續發光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內穩定表達。已經標記好了幾十種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，在這方面很有經驗。具體標記情況請與我們直接聯繫。
關於儀器的特性等問題
20. 為何活體成像技術能看到體內發出的可見光？ 兩個主要原因使可見光成像技術能夠看到體內發出的微弱的可見光。一是高靈敏度的製冷CCD鏡頭，可達到零下-90°C，使體內發出的非常少的光子也能夠檢測到。 二是絕對密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括宇宙射線在內的所有光線。
21. 正常成體小鼠可以看到體內發光嗎？ 是否不需要裸鼠？ 可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區別只在與對可見光的穿透性不同，我們的技術可以看到成體正常老鼠的體內發光。這正是這項技術的價值所在。可見光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作為活體成像的動物， 並有很多關於大鼠的文章。
22. 能檢測在組織內部的發光嗎？光能透過肌膚多深？ 可以。若有發光足夠強的標記細胞，在老鼠體內任何一個地方都能看到約一立方毫米的細胞瘤(約106細胞)。穿透性可達到3-4CM (小鼠身體厚度約7-8 CM)。
23. 儀器靈敏度如何？ 儀器對發光細胞檢測的靈敏度與細胞發光的強度有關。在標記細胞活躍發光的情況下， 儀器可以檢測到最少100個皮下接種的發光細胞。若細胞在體內位置深(如原位種植)，比如內臟，最少能檢測到的細胞數目需要多一些。一般每增加0.5cm可檢測到的最少細胞數增加一個數量級。
24. 能檢測分散在各處的單個細胞嗎? 可以檢測到流體的細胞，只要細胞總數達到100以上。許多文章，其中用螢光素酶標記了T細胞，NK細胞，造血幹細胞和其他淋巴細胞。在這些標記的細胞總數達到一百以上時，我們的儀器可以觀察到信號。
25. 活體成像技術如何定量分析？ 活體可見光成像技術採取絕對光子數的計算方法，記錄單位時間內、單位面積、單位角度接受到的光子數。這樣，不同時間、不同儀器的測量結果可以進行比較，具有絕對的定量意義。每一個新標記的細胞株都要進行全面的定量分析才能用於定量實驗，其中包括在體外和體內固定位置細胞發光的標準曲線。
26. 不同的組織對光的吸收程度不一樣，不同的組織之間能進行定量研究嗎？ 不能。目前的文獻都是同樣的組織比較，進行同樣組織的前後不同時間的定量分析。
27. 螢光素酶的發光強度是否同細胞的數量成正比？ 是的，螢光素酶的發光強度同標記的靶點, 包括細胞、基因、細菌和病毒的數量成正比。密西根大學Brian Ross發表的一篇文章專門研究了這個問題。確定螢光素酶的發光強度與細胞數成正比關係，並且線性關係到0.9 以上。
28. 儀器的解析度如何？解析度如何？ 儀器的最高解析度在0.1毫米左右。由於可見光是漫射光，在體內走的路線不是直線，所以該儀器的體內光源的解析度不是很好，通過該儀器觀察的發光圖片不能代表發光物質的結構信息，在動物體表所捕捉的發光信號只能代表發光的強度和大概的位置。小動物CT和MRI，在這方面具有優勢，因為放射線走的路線很直。
29. 能定位在哪個臟器嗎？憑什麼？當進行腫瘤轉移研究的實驗時，在觀察期間，不殺死動物，如何判斷某一部位發光是由於皮膚、皮下組織，肌肉，臟器還是骨骼的腫瘤轉移造成的發光？特別是對於一些較小的臟器，如淋巴結轉移。 此技術無法直接定位標記細胞和基因所在的組織和器官。但是實驗人員憑經驗，可以靠發光細胞在老鼠的身體位置推斷標記細胞或基因所在的臟器。若需要證實，還需要將老鼠解剖，進行體外檢測。
30. 拍攝普通照片的和生物發光照片的是一個CCD鏡頭嗎? 是，只不過爆光時間和快門不一樣。
31. 鏡頭那麼低溫度，動物不會凍死嗎？ 低溫只是在CCD鏡頭的小環境內。其它範圍內都是室溫。
32. 使用麻醉機相對於腹腔注射麻醉有什麼優點？ 麻醉系統可以對小鼠的麻醉情況包括時間，程度等有更精確的控制。使用起來也會更加方便。
33. 螢光配件相對於其他公司的螢光的優勢在哪裡？ 相對寬的應用範圍，可以觀察波長在400-900nm的螢光，因此適用於GFP及各種螢光染料的標記。還有一套12張專門的濾光片用來消除非特異性的背景光。並且其成像速度快，適合大批量的實驗。