螢光顯微成像技術簡介

1. 螢光

螢光是當分子受到光激發時，電子從基態躍遷到不穩定狀態的激發態，電子從第一激發單重態的最低振動能級回到基態並發出輻射的光。螢光光譜包括激發譜和發射譜兩種。激發譜是螢光物質在不同波長的激發光作用下測得的某一波長處的螢光強度的變化情況，也就是不同波長的激發光的相對效率；發射譜則是某一固定波長的激發光作用下螢光強度在不同波長處的分布情況，也就是螢光中不同波長的光成分的相對強度。

Jablonski能級圖

受到光激發的分子，電子從基態躍遷到激發態，電子在吸收光的能量後，可能到達第一激發態的高振動能級或第二激發態，這個時候電子會經歷內轉換或馳豫振蕩過程到達第一激發態的最低振動能級。由於激發態是不穩定狀態，電子從第一激發單重態的最低振動能級回到基態並發出輻射。

奎寧螢光光譜

螢光光譜具有三個特點：發射光譜與激發能無關；鏡像規則：發射光譜通常是吸收光譜的鏡像；斯託克斯位移：與螢光發射躍遷相關的能量通常小於吸收能量。

2. 基本結構

傳統的光學顯微鏡是基於宏觀樣品特徵，如相位梯度，光吸收和雙折射等，因此只能成一個宏觀整體的像。

光學顯微鏡

將螢光光譜技術利用到顯微成像技術上可以基於樣本發射螢光的特性對單個分子物質的分布進行成像，監測細胞內部特定螢光團標記的成分的確切位置以及相關的擴散係數、轉運特性、或與其他生物分子的相互作用等。

螢光顯微鏡

典型的螢光顯微鏡是利用汞弧燈作為激發光源並配合使用一組特定的濾光片及二向色鏡來對樣本進行高效率的照明同時分離出微弱的螢光信號，其成像系統結構如上圖所示。螢光顯微鏡主要利用了螢光探針的高度特異性，它能夠在複雜的混合物中選擇性地探測濃度非常低的螢光標記目標。此外，由於螢光的高靈敏度和空間解析度使得螢光顯微鏡能夠在衍射受限的光學解析度下的長度範圍內對單個分子精確定位。

螢光顯微鏡結構示意圖

3. 主要類別

3.1 寬場螢光顯微鏡

最常見的螢光顯微成像技術就是傳統的寬場螢光顯微鏡，但它只能對事先切片的樣品進行成像，不具備光學切片能力，對於厚度大於2微米的三維樣品，寬場照明會使得整個樣品體積內的螢光標記發射螢光，這些離焦光會遮掩焦面上的細節從而極大降低了對比度。

3.2 結構光照明顯微成像技術

寬場螢光顯微鏡低對比度的問題可以通過在系統中加入結構光照明調製來解決，如正弦條紋照明裝置，這樣就可以通過算法重建得到光學切片圖像，這種方法結構簡單容易實現且成像速度較快。

結構光照明顯微成像技術示意圖

3.3 雷射掃描共聚焦顯微鏡

另一種螢光顯微成像技術是雷射掃描共聚焦顯微鏡，它是目前使用最廣泛的光學切片技術，其系統結構如下圖所示。它是通過使用聚焦的雷射束掃描樣本，並在探測器前放置一個可調節的針孔濾除離焦的雜散螢光來獲得樣品的光學切片圖像。相比於傳統的寬場螢光顯微鏡，雷射掃描共聚焦顯微鏡具有一個放置在與中間像面及物面共軛的平面上的共聚焦針孔，因此探測器只能探測到通過針孔的螢光信號。

雷射掃描共聚焦顯微鏡示意圖

由於背景螢光的減少以及信噪比的大幅提高使得共聚焦螢光顯微鏡的成像質量大大優於寬場螢光成像技術，同時其非侵入式的共聚焦光學切片技術能夠在各種條件下對活體樣本或固定樣本進行三維成像，且清晰度更高。但由於其是點掃描式成像，其成像速度較慢。此外，共聚焦掃描顯微鏡大多使用雷射作為光源激發樣品螢光，雷射的激發波長十分有限，並且頻帶較窄，同時高強度的雷射輻射容易對生物組織產生破壞。而傳統的螢光顯微鏡使用汞弧燈或氙燈可以在紫外波段、可見光波段及近紅外波段提供完整的激發波長光譜範圍。

寬場（上）與共聚焦（下）成像對比

3.4 雙光子螢光顯微成像技術

雙光子激發螢光過程是一個螢光分子同時吸收兩個長波激發光子，發出一個短波螢光光子，屬於非線性過程。雙光子激發需要高功率激發光源和高光子密度，只有在焦點處的微小區域內樣品才能夠吸收足夠的能量而發出螢光。其激發光源為近紅外或紅外，因而光漂白和光損傷小（只在焦平面上有損傷，且長波長光對細胞毒性小），具有高成像靈敏度（激發波長離螢光波長比較遠，可以最大限度的收集螢光），且探測深度深（樣品對激發光散射弱）。

雙光子螢光顯微成像技術示意圖

參考文獻：

[1] 孫超偉.近紅外螢光顯微術用於活體組織的深層成像研究[D]. 浙江大學, 2018.

[2] Wilhelm, S., Grobler, B., Gluch, M., & Heinz, H. (2003). Confocal Laser Scanning Microscopy. Principles. Microscopy from Carl Zeiss, microspecial.

[3] Basic concept in fluorescence.

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