導讀
近年來，研究者將一系列超分辨成像技術與螢光偏振顯微術結合，實現了納米尺度上乃至單分子水平的螢光偶極子成像。北京大學席鵬副教授課題組總結了已有的螢光偏振成像技術，介紹了最近開發的兩種超分辨螢光偏振成像技術，比較了各種螢光偏振成像技術的優劣。該篇綜述文章以「Super-resolution fluorescence polarization microscopy」發表在期刊 Journal of Innovative Optical Health Sciences 上。
作者簡介席鵬副教授，北京大學工學院研究員。致力於光學超分辨成像技術的研究，發展了一系列新型超分辨技術。2015年當選美國光學學會資深會員，和中國光學學會生物醫學光學分會常務委員。現擔任五份SCI收錄國際學術期刊的編委：Light: Science and Applications, Advanced Photonics，Scientific Reports, Microscopy Research and Techniques, 和Micron。在Nature, Nature Methods等國際一流期刊發表SCI收錄期刊論文60餘篇。2016年獲得中國光學重要成果獎。2018年獲得北京市傑出青年科學基金。已授權美國專利3項，中國專利8項，編輯專著2部。多次被OSA和SPIE組織的國際會議邀請作大會邀請報告。張昊博士，南方科技大學研究助理教授。2017年獲得北京大學-美國喬治亞理工-埃默裡大學三校聯合博士學位，導師為席鵬教授。開發了一系列螢光偏振技術，如：（1）利用偏振特性的螢光偶極子超分辨技術(SDOM)發表在Light: Science and Applications期刊，並得到Nature Methods的高度評價；（2）參與將SDOM應用於金納米粒子的SERS超分辨成像(Nanoscale 2018)；（3）開發偏振結構光照明顯微術(pSIM)並發表在Nature Communications期刊，該技術以高的空間解析度和準確的偏振檢測，揭示了肌動蛋白環在MPS中「並排」組裝的新模型，推翻了以往教科書上的肌動蛋白環「端到端」的結構假設。
綜述背景
絕大部分螢光分子都是螢光偶極子，其光子吸收效率受激發光的偏振方向調製，它們發出的螢光也是偏振的。作為光的基本物理屬性，螢光偏振在生物學研究中獲得廣泛應用。通過螢光偏振顯微術(Fluorescence Polarization Microscopy, FPM)，可以在測量螢光探針強度的同時測量偶極子的方向。由於螢光分子的取向與所標記的生物結構相關，螢光偏振成像可以揭示標記樣本的結構信息。儘管X射線晶體學或電子顯微鏡可以獲得單個蛋白質或大分子裝配體的超高解析度，但它們需要非常複雜的樣品製備方法，不適合活細胞成像。近場成像技術，例如原子力顯微鏡(AFM)也可以提供與結構信息，但是被限制於樣本表面的研究。螢光偏振顯微成像能夠以秒或毫秒為單位對動態樣本中的分子方向進行成像，因此它可以作為測量亞細胞生物結構的一種補充方法。近幾十年來，各種不同的螢光偏振成像技術被廣泛用於細胞膜，細胞骨架，DNA鏈，以及其它生物大分子的研究中。
螢光偏振成像技術也在不斷發展進化中，早期研究者們需要通過手動或機械方式來調製激發光偏振方向或者切換偏振檢測通道。隨著新型電光調製設備(Electro-optic Devices)的發展，成像速度和偏振探測精度都獲得了大幅提升。而且，螢光偏振成像實現了與多種成像方式的結合使用，例如寬視成像，雷射掃描共聚焦成像，雙光子成像，全內反射成像等等。但是，作為一種光學成像技術，衍射極限限制了螢光偏振顯微術的發展。與多種對螢光光強成像的超分辨技術相比，針對螢光偏振成像的超分辨技術仍處於起步階段。
綜述內容
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螢光偶極子及生物結構標記
圖1.螢光偶極子示意圖。以綠色螢光蛋白(GFP)為例，它的偶極子取向（c-c』水平方向）與化學結構的關係如圖所示。當螢光偶極子用來標記生物結構時，由於衍射極限的約束，螢光偏振顯微術觀察到的是衍射極限的多個螢光偶極子集合體。因此除了平均偶極子取向以外，研究者還通過集合偶極子擺動角來描述偶極子取向分布的有序無序。比如，在研究細胞膜時，集合偶極子擺動角的大小反應了脂質分子的有序性，可以進一步揭示膜的相位信息。
偏振調製下GFP螢光蛋白的光強變化
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不同原理的螢光偶極子顯微術
圖2.三種不同的螢光偏振顯微術的光路示意圖。由於螢光偶極子的激發效率與激發光的偏振方向有關，因此可以通過偏振調製（又稱為線性二色性）的方法來測量螢光偶極子取向，如圖(b)所示。同時螢光偶極子發射的螢光信號也是偏振的，因此可以在探測端通過不同偏振通道來檢測偶極子取向，圖(a)中所採用Wollaston稜鏡是一種產生不同偏振探測通道的方法。由於發射螢光的偏振特性，當螢光偶極子在成像中離焦時，離焦圖案也會隨偶極子取向變化，因此通過離焦圖案識別的方法也可以檢測偶極子取向，如圖(c)所示。
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不同原理的超分辨螢光偏振顯微術
圖3.兩種超分辨螢光偏振顯微術的原理介紹。第一種技術是超分辨螢光偶極子測繪技術(Super-resolution Dipole Orientation Mapping, SDOM)，如圖(a)所示。該技術利用一個旋轉半波片來調製激發光的偏振方向，並結合稀疏反卷積進行偏振解調製，從而提升螢光偶極子成像的空間解析度和取向角度解析度。圖(b)通過簡單的仿真闡釋了SDOM的原理：兩個很近螢光偶極子（紅色和綠色代表不同的取向）在寬場下完全無法區分，看起來像是只有一個螢光團；膽汁在偏振調製的情況下，可以明顯觀察到左右兩個偶極子先後達到最亮，最終通過偏振解調製算法我們可以同時得到這兩個螢光偶極子的位置和取向。第二種技術是結合單分子成像和螢光偏振顯微術，其中最簡單的是在單分子顯微鏡的探測端採用不同探測通道（如圖(c)所示）分別進行單分子成像和定位，通過比較同一個螢光分子不同通道的強度來得到偶極子取向。單分子螢光偏振成像的優勢是能夠對每一個螢光偶極子單獨成像。
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超分辨螢光偶極子成像結果
圖4.不同超分辨螢光顯微術對肌動蛋白纖維的成像結果。圖(a)是SDOM技術的成像結果，圖(b)是偏振單分子成像結果，它們的偶極子取向由線段方向表示。圖(c)是利用單分子追蹤技術對活細胞肌動蛋白的成像結果，偶極子取向有色彩表示。比例尺：a，200 nm；b，1.5 μm；c，1 μm。
最近，該課題組發展了偏振結構光成像技術(pSIM)，並將其應用於多種不同的細胞器成像中。為了驗證這一技術與SIM的廣泛兼容特性，研究人員測試了多種商用SIM系統及自主搭建的SIM平臺，以及2D-SIM、3D-SIM、TIRF-SIM成像能力，成功提取螢光分子的偶極子方位信息與超分辨結構信息。同時，研究人員進行了大量的生物學實驗來證明pSIM廣泛的適用性，如λ-DNA、BAPE細胞和小鼠腎組織中的肌動蛋白絲、肌動蛋白和肌球蛋白之間的相互作用，以及中GFP染色的U2OS活細胞微管。
例如，在肌動蛋白actin和負責細胞輸運的肌球蛋白myosin的相互作用中，研究人員發現，肌球蛋白在ATP驅動下，可以讓肌動蛋白絲發生「漂移」。通過pSIM技術，可以對這一漂移的不同長度的肌動蛋白進行方向和運動的跟蹤，而以往的SIM只能對其運動進行跟蹤。
pSIM揭示了肌動蛋白actin和負責細胞輸運的肌球蛋白myosin的相互作用
特別是，研究人員針對神經元中的膜相關周期骨架(MPS)進行了研究。pSIM以高的空間解析度和準確的偏振檢測，揭示了肌動蛋白環在MPS中「並排」組裝的新模型，推翻了以往發表在Science上的肌動蛋白環「端到端」的結構假設。
圖5.pSIM揭示了肌動蛋白環在MPS中「並排」組裝的新模型，推翻了以往的肌動蛋白環「端到端」的結構假設。
討論與總結
表1 不同螢光偏振成像技術的比較
單偶極子追蹤成像可以在微秒時間尺度上實現單個分子的位置跟蹤和偶極方向測量。定位精度可能高達幾納米。它在研究肌球蛋白(myosin)的旋轉運動和ATPase 的步進旋轉旋轉等問題時取得了巨大的成功。然而，單偶極子追蹤只能用於稀釋標記的樣品，無法揭示樣本的整體結構。偏振單分子成像（偏振隨機光學重建技術，polar-dSTORM）通過對螢光探針進行開-關調製並獲取足夠的幀來重建超解析度圖像。它的成像解析度高，定位精度可達數十納米，但是缺點是成像時間長（2-40分鐘），在成像期間樣品需要固定，從而難以對活細胞樣品進行成像。
超分辨螢光偶極子測繪技術SDOM則可以實現150 nm空間解析度和亞秒時間解析度的成像，同時獲得高精度的取向角測量，可以被用於固定細胞和活細胞成像。與polar-dSTROM相比，SDOM 的缺點是只能測量平均偶極子，無法將單個螢光團的擺動信號與螢光團的取向分布區分開。此外，SDOM技術對沒有偏振特性的樣本成像時不能得到超分辨效果。
偏振結構光照明顯微術(pSIM)普適於任意樣本，能過獲得兩倍的空間解析度提升（橫向解析度100 nm，軸向解析度300 nm）。由於其高時空解析度，結構光照明成像非常適合活細胞成像，近年來在亞細胞成像，細胞器互作研究等領域成果豐碩。而偏振結構光照明顯微術能夠在已有的SIM系統上直接使用，額外獲得螢光偶極子的取向信息，在未來解決各種生物問題方面具有廣闊的應用前景。