【Light在線】問答實錄:超分辨成像與單細胞分選技術

視頻實錄：「」Light在線」第2講—超分辨成像與單細胞分選技術

1. 問：STED技術可實現的解析度有沒有極限？STED能否實現組織或者活體成像？

答：理論上無極限，受限於樣本材料的大小。實際一般可實現30nm左右，主要用於細胞成像，也有用於老鼠腦的研究。

2. 問：STED 是共聚焦顯微成像的提升（laser confocal microscopy），只是在增加了一個背景光，來關閉背景螢光的產生，現在STED的成像速度如何？如何解決類似雷射共聚焦成像速度的問題呢？

答：STED基於共聚焦顯微鏡，在共聚焦的基礎上增加STED光來提升解析度。速度的話普通共聚焦點掃描的話一般會慢些，用共振鏡掃描會比普通檢流計振鏡快些。轉盤式共聚焦會明顯提升速度。商用STED一般會用到振鏡掃描，用共振鏡速度會快些。

3. 問：STED技術如何提高軸向解析度，實現三維超分辨呢？目前都有哪些技術呢？

答：可以做三維的donut環形光，擦除z軸的光，來提升解析度。不過提升z軸解析度，一般會導致xy方向解析度有所下降。用mirror enhanced STED也可以提升z軸解析度。

4. 問：STED第一個方法，中間暗的光束是不是就是渦旋光束？那渦旋光束的拓撲荷數目是否會影響解析度？

答：是的，中間暗光是渦旋半波片調製出來的。您說的拓撲荷數目是指階數嗎？您說的對，這個階數會影像解析度，階數高了的話會導致中間黑圈太大，解析度下降，一般用低階。

答：受激輻射了，類似雷射產生的原理，發射光和入射光一樣，不發螢光，後面會被濾光片濾掉。

答：傳統顯微鏡解析度極限，主要是阿貝衍射極限，和光波長，物鏡數值孔徑NA有關。

7. 問：用鏡像與原始信號幹涉，應該是受到深度的影響啊，不同的深度幹涉信號應該有強有弱，這一點如何處理？

答：對的，不同深度信號會有變化，也正是因為有明暗的變化，把一部分明條紋壓縮了才能提高解析度。在我們用到的明條紋裡，這個信號變化應該是可接受的。或者可以這麼理解，普通的PSF也是中間光強大，越往外光強越弱，呈高斯分布。

9. 問：光束相減的方法能實現STED嗎？就是兩束同波長的光光強相消，直接把光斑變小？

答：您說的是兩個是實心光嗎？兩個實心光的話理論上不能實現STED，信號全沒了。同波長一個實心，一個donut可以實現STED，參考：Bianchini P, Harke B, Galiani S, et al. Single-wavelength two-photon excitation–stimulated emission depletion (SW2PE-STED) superresolution imaging[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(17): 6390-6393.

10. 問：減小激發波長可以有效提高解析度，Sted 為何不會像光刻技術一樣，去追尋更短的波長作為激發和損耗光呢？

答：可以減小激發光提升解析度，但是太小到紫外的話，對細胞有毒害作用。

11. 問：bessel光場的旁瓣會不會對超分辨成像都對比度帶來影響？

答：不會有影響，因為bessel光是STED光，不用來激發，只用來去激發，所以旁瓣是沒有影響的。

13. 問：用環形光替代高斯光束做共聚焦的光源，可以縮小艾裡斑直徑，這樣可以提高系統的解析度，這也算超分辨吧？

答：你的想法很好，minflux技術用的環形光照射結合了單分子定位，解析度很高。

14. 問：上轉換材料的長壽命是否會對STED成像造成影響？

答：不會有影響，因為受激輻射的過程很短，而且可用門控的方法來調整採集時間。

答：UCNPs抗淬滅性能好，連續拍幾百分鐘沒問題。

16. 問：調製Bessel成中空形狀後，它一直沿著激發光傳播方向照明，對樣品的造成的光毒性如何？離焦面造成的背景噪聲影響大嗎？

答：STED光光強太強的話都會有光毒性，一般會平衡光毒性和解析度，取一個適合的光強數值，使得在滿足要求的解析度率下又儘可能降低光毒性。Bessel只用來擦除，不用來激發，所以背景噪聲不會影響。

17. 問：請問上轉換材料的生物相容性如何？會對細胞有毒性嗎？

答：上轉化材料以前挺難標記到生物上的，不過現在可以用來細胞成像了，低濃度下細胞毒性應該不大。

18. 問：為什麼GB-STED比STED可以滲透更深？

答：因為貝塞爾光可以在z軸上拉的比較長，普通sted匯聚時z軸較短，如果只調樣本z軸，會被散射，打不太深。

19. 問：對於上轉換，增加濃度的依據是什麼？不同的對象濃度上限是多少？有沒有一個比較好經驗依據？

答：增加濃度的話就可以越亮，抗淬滅性能更好，可以亮更久。一般8%的濃度就挺好。

答：激發光一般不會做成bessel，z軸激發太多，可能會增加背景噪聲。

21. 問：上轉換納米顆粒的效率比較低，在應用於超分辨成像時發光會不會比較弱，單個顆粒的亮度是多少，與螢光染料相比呢？能否更好的應用於生物超分辨成像中？

答：可以提高參雜濃度來提升亮度，上轉化材料抗淬滅性好，一般能亮更久，在生物成像中就可以做長時間STED成像。

22. 問：STED激發的波長一般是多少？是根據不同細胞的螢光特性選擇嗎？

答：您說的對，要看材料選擇，有640nm激發，760nm STED；也有500多激發，600多STED的。

23. 問：多焦點結構光照明技術有什麼優勢和前景？

24. 問：不知席老師是否了解其他類似的採用反射鏡提高軸向解析度的方法（比如1993年的Nature提出的駐波顯微鏡是寬場+反射鏡；2010年的PRL也是點掃描+反射鏡，只是反射鏡的擺放位置和MEANS有所區別），和MEANS相比有什麼不同相同點和優缺點呢，可否稍作評價。

答：在我們發表的MEANS文章裡，Nature寬場的反射鏡是一層一層的，還是沒辦法解決只成一層，我們解決了這個問題。PRL的觀點覺得是沒辦法實現這種幹涉，但是我們把它實現了，可以參考我們文章的SI：Yang X, Xie H, Alonas E, et al. Mirror-enhanced super-resolution microscopy[J]. Light: Science & Applications, 2016, 5(6): e16134-e16134.

25. 問：現有STED的退激發光功率大概在什麼量級？

26. 問：想從應用的角度了解有關STED幾點：（1）精度問題：XY解析度，Z軸解析度各能達到多少ｎｍ，１０ｎｍ？（2）想用來做３D活體成像，其光對活體損傷性，以及成像速度，對比下要選擇那種超分辨技術，了解到還有MINFLUX，結合了STED和PALM。

答：X，Y解析度和環形光有關，大概在50nm左右，一般商用系統會介紹說最好能到30nm，典型值50nm。速度方面，有28幀/s，可做活的。活老鼠那個STED實驗也可以到60nm。

27. 問：怎麼減少超分辨顯微鏡對細胞的光損傷？染料的光漂泊？

答：Stefan Hell組有關於光漂白的研究，改雷射的佔空比。

答：共聚焦就是提高信噪比的方法，通過pinhole隔絕離焦背景，如果是隨機噪聲也可以多次採樣取平均。

29. 問：STED技術中，光源的選擇有哪些需要注意的？光源的噪聲對解析度和成像影響大不大？

答：光源選擇，一般用脈衝光，也有gated STED用的CW連續光。光源噪聲會有影響。

30. 問：目前超分辨顯微鏡的成像深度是多少，是否只能用於細胞研究？

答；GB-STED在8微米左右，普通的更小，對的目前主要用於細胞層面，不過也有我們提到的對小鼠腦成像的。

31. 問：共振振鏡做快軸掃描需要畸變，某些共聚焦裡用polygon做快軸掃描，是否需要畸變校正？

32. 問：鏡像方法STED的工作中，為了獲得臨近鏡面區域的幹涉增強，壓縮激發光的點擴散函數，那麼是否意味著失去了z方向三維成像的能力？

答：壓縮了以後反而能提高z軸的解析度，只要移動樣本平移臺z軸即可三維成像。

33. 問：損耗光的空心焦斑的尺寸會影響STED的解析度嗎？另外，激發光的焦斑尺寸會對STED的解析度產生什麼樣子的影響？可以用超分辨的透鏡替換傳統物鏡嗎？

答：會影響的，主要看STED的光強，光強越強，空心越小，解析度越高。

34. 問：採用角相偏振光入射，產生空心光環聚焦焦斑，另外，空心焦斑的偏振態是否對其解析度產生影響呢？

35. 問：如果我想要研究UCNPs STED裡面能級圖建立和數值計算分析，有沒有哪些文章可以推薦閱讀，想知道裡面的上轉換過程和交叉弛豫過程。

答：可以參考我們的文章：Liu Y, Lu Y, Yang X, et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy[J]. Nature, 2017, 543(7644): 229-233.

36. 問：我們知道SIM是需要算法還原出超分辨圖像 STED後期是否需要算法處理？

37. 問：席鵬老師很詳細地介紹了超空間分辨的生物成像技術，是否可能將超空間分辨的技術與超快時間分辨的技術相結合，從而觀察生物化學過程中的一些超快過程？目前是否已有這樣的工作？

答：MINFLUX的空間解析度和時間解析度都很高。

38. 問：請問像共聚焦或者STED顯微鏡的PSF為什麼是激發PSF和成像PSF相乘？

答：可以考慮下激發是樣本端有個psf，探測器端接收時有個psf，列一下成像過程，可以看出是兩個psf相乘，可以看下Image scanning microscopy （ISM）相關文獻。

39. 問：對於結構光照明中只考慮了xy方向上的偏振，只能顯示在平面上的結構屬性，忽略了z方向上的結構，是否能用三維矢量光照明實現三維結構的的分辨呢？

40. 問：鏡面反射的鍍層矽材料有沒有自發螢光幹擾樣品螢光信號？

42. 問：STED超分辨應用中，對雷射光源方面主要考慮哪些參數呢？

43. 問：可以用超解析度的思想來對紅外線成像嗎？

答：近紅外的有用，紅外的波長長了些，會降低解析度，一般不太用於生物成像。

44. 問：對您那個bessel光場調控sted的工作非常感興趣，想了解下是否考慮過使用焦深更長的airy beam去代替bessel beam？

45. 問：環形光會聚的光斑大小相比於一般的實心光束會聚能小多少？

答：環形光整體比實心光大（300nm），把它覆蓋住，環形光的黑心部分小（30nm）。普通顯微鏡300nm解析度，STED實際一般最佳情況下可達30nm解析度。

46. 問：貝塞爾光做激發時，用針孔濾波的方法是不是可以抑制旁瓣？

答：應該是可以的，不過小孔pinhole一般也有大小，太小的採集到的信號太弱了。

47. 問：大部分的光場調製都在調製激發端來實現超分辨，包括sted，sim，storm，有沒有可能在收集端進行光場調製進行超分辨？

答：Imaging scanning microscopy也是基於confocal，應該算在探測端有些調製處理。

48. 問：普通共聚焦顯微鏡升級STED附件大概需要多少錢？聽說stefan已經商用化這個模塊了。

答：自己做的話主要貴在雷射器，探測器等，雷射器價格差別就很大了，所以不太好估計，如果只是光學鏡片之類的應該不貴。Leica有賣STED整機的。

50. 問：環形光是暗場成像麼？利用了散射光進一步強化了細節，但是沒突破衍射極限。

答：環形光主要依賴於渦旋半波片，它的中心可以很小，和STED光的光強有關。

答：主要有STED，SIM，PALM這三個，前兩個是廣場調製，後一個是單分子定位。也有ISM，MINFLUX等超分辨技術。

52. 問：請問是2nm解析度那個文章嗎？不記得用了環形光束啊。不知道他們如何消除旁瓣的幹擾的？

答：MINFLUX實現了2nm解析度，也用了環形光。

53. 問：能不能設計一個衍射原件，使得其聚焦直接得到三維球狀結構？

答：3D STED主要依靠三維donut，在z軸上形成donut環，目前商用的STED系統上可實現。

55. 問：偏振方向與信號是cos分布，那如何分辨兩個對稱的方向？

這取決於用幾個方向去探測，關於對稱性的描述可參考D. Y. Shroder, L. G. Lippert, Y. E. Goldman, Single molecule optical measurements of orientation and rotations of biological macromolecules. Methods Appl Fluoresc 4, 042004 (2016).這篇文獻FIG4的介紹。我們介紹的SDOM和pSIM技術可以探測區分0-180°的角度範圍。

56. 問：偏振超分辨能否用於生物體，因為細胞是一個複雜的雙折射物體，退偏比比較複雜，這個方法能否使用？

答：可以用於生物體，我們展示的結果都是生物樣本的成像結果。

57. 問：是不是類似於液晶光控取向技術，採用旋性相反圓偏振光進行疊加來動態形成不同偏振態的光，來進行光場偏振調控?

答：是進行偏振光場調控。不過這裡我們考慮的情況比較簡單，是對線偏振光進行調控。可以用旋轉半波片或者電光調製器等器件來實現。

58. 問：關於偏振結構光這裡，對於雷射幹涉的相干SIM成像系統，結構光投影過程受MTF的限制，沒辦法產生高對比度精細條紋，這個難題有沒有較好的解決方向? 還有就是在SIM系統中，用偏振調控的話，因為用到大NA物鏡，它幹涉成像時雷射偏振態不能忽略，這個難點的解決思路應該如何?

答：利用投影產生的結構光確實會受到MTF的限制，但幹涉受到的影響會小一些。本身好的SIM成像系統需要兩束幹涉光的偏振方向高度一致才能產生高對比度的精細條紋，所以系統中的偏振控制和補償非常重要。我們採用一對s和p軸垂直放置的二向色鏡來進行成像系統中的偏振補償，同時採用渦旋半波片來控制偏振旋轉，具體可參考我們文章中詳細介紹。

59. 問：和其他超分辨技術相比，您能分析下結構光照明超分辨技術的優劣勢，還有SIM未來的發展趨勢如何？

答：結構光照明實際上是目前生物學家比較喜歡的超分辨成像技術，因為它不需要特殊的樣品製備，生物學家可以直接用傳統的螢光樣本獲得一個比較好的超分辨圖像。所有的超分辨成像技術實際上是用時間來換取空間的，解析度越高，在同樣的信噪比下成像速度越慢。SIM是超分辨技術裡成像速度相對較快的。我們在2018年和北京大學的陳良怡教授合作的Hessian SIM可以實現97Hz的時間解析度。關於 SIM未來的發展趨勢，SIM最大的問題是在於它是一個空域調製，頻域處理最後再反推到空域的過程，頻域延拓的過程中會帶來一些artifact 。這些偽影的去除是SIM要解決的問題，以及nonlinear SIM也會是未來的發展方向。

60. 問：剛剛的偏振特性似乎在xy方向，想問一下，在z方向如何？沿深度方向拓展，進行三維成像是如何實現的呢？

答：確實我們剛才展示的這些技術只是二維方向上的信息，沒有z方向上的component。要想進行z方向的解析，情形會複雜一些。我們目前也在通過一些調製的技術讓它能同時具備xyz三個方向的投影，當然你也可以利用他技術的一些優勢來實現三維成像，比如3D-SIM。三維取向信息的測量也是我們未來努力的方向。

61. 問：在偏振超分辨成像中，螢光分子的取向為什麼能夠代表生物結構的取向呢？螢光分子在標記生物結構時是有一定的取向關係的嗎？

答：這個問題很好。偏振成像標記需要標記的螢光分子和生物靶分子之間的連接是剛性的，這樣才能通過對螢光分子的取向解析反應生物靶分子的取向信息。

62. 問：用於標記的螢光材料中的偶極子對偏振光的敏感度跟最後成像的解析度之間是什麼樣的關係呢？如果標記材料跟生物物體之間的結合力的強度對偏振響應有沒有影響呢？

答：偏振螢光成像的前提是螢光分子對偏振光是敏感的。大多數螢光分子都可以看做偶極子的。標記材料與生物靶分子之間的結合力足夠強才能通過標記材料的取向反映生物靶分子的取向。所以偏振成像需要對標記分子做一定的選擇。一般的小分子染料和螢光蛋白都是偏振敏感的，但很遺憾抗體標記對偏振是不敏感的，所以無法用於螢光偏振成像。

63. 問：老師能否再分享一點您了解的在DNA領域的應用？

答：我們課題組還使用過DNA Origami進行過偏振成像。

64. 問：polarized SIM中，有各個偏振考慮，一個是傳統SIM需要的偏振（入射光偏振需要為p偏），一個是偏振重構（入射光偏振需要轉動），這兩個偏振是怎麼考慮，以及實驗上結合起來的呢，總感覺兩個偏振的要求是有些互相矛盾的，以及偏振方法在活細胞上的應用。

答：SIM成像使用的是兩束s偏振光進行幹涉的，實驗中我們使用渦旋半波片來控制偏振光的旋轉，也可用Pizza半波片來實現。具體實驗可參考我們文章中SI的光路圖。K. Zhanghao et al., Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nature Communications 10, 4694 (2019).文章中同樣介紹了pSIM對U20S細胞的微管動態成像結果。

65. 問：關於偏振超分辨顯微鏡，對螢光納米晶的自主裝取向是否能分析？

答：螢光納米晶的組裝取向是否會影響它的偏振響應，如果會的話可以用pSIM進行解析。我們也非常歡迎大家和我們合作一起來開發新的偏振成像應用領域。

66. 問：在SDOM中，讓線偏振的入射雷射轉動方向，如何看出樣品的發光偏振？

答：螢光偏振成像分為偏振激發和偏振探測。旋轉入射雷射的偏振方向屬於利用偏振激發來實現螢光偏振成像的。螢光偶極子對不同方向線偏振光的激發響應不同，我們通過探測這些不同的響應進行分析從而來解析取向信息的。

67. 問：高NA拉曼物鏡 的WD是多少？最大的NA達到多少？可以用到市場上的商業顯微鏡上嗎？

答：辰英自己設計的兩款近紅外物鏡：油鏡是1.2NA，工作距離0.3mm；空氣物鏡0.9NA，工作距離1mm。兩款物鏡在650-1000nm透射率大於95%。目前只能應用在我們自己的設備裡。

68. 問：不同細胞的拉曼光譜相似度怎樣？拉曼光譜系統對生物樣品的識別率和準確率有多高？

答：拉曼光譜的識別率不單取決於拉曼光譜解析度和信噪比，也取決於樣品的規範處理和識別算法，我們目前開發的算法可以實現在庫細胞90%以上的準確率。

69. 問：把單細胞分離出來的具體物理機制是什麼？是通過分選晶片上的機械裝置還是光鑷原理？

答：該項技術應用光與物質相互作用原理，實現光與晶片介質產生推力，從而將細胞分離出來。

70. 問：對共焦拉曼的細胞成像來說什麼樣品展示度比較高呢？或者說可以推薦一些拉曼信號較強且拉曼峰比較典型的生物樣品嗎？

答：一般來說生物樣品的拉曼信號都不會像材料那麼強，且峰譜複雜，進行拉曼成像主要還是要利用成分提取等算法從樣品的複雜光譜得到關鍵信息，從而呈現出象徵各種成分分布的熱圖。若要呈現出比較好看的圖像，可選擇細胞內亞結構較多的動物細胞或組織。

71. 問：細胞分選過程中是如何保護細胞的？是否有損傷機率呢？

答：分選過程是皮秒級別的，產生的分選損傷很小，而且在細胞接器中加入溶液，細胞活性還可以保持。

72. 問：自發拉曼散射信號應該是極其微弱的，您是否有開發受激拉曼散射成像的設備？可否分析下受激拉曼與自發拉曼的優劣勢。

答：受激拉曼是一種非標記多光子技術，具有很好的化學選擇性和靈敏度，可以很好的應用於細胞中物質分布的三維成像，自發拉曼相比受激拉曼顯示的信息更豐富，可廣分應用於細胞識別與分類。而且在設備層面受激拉曼需要兩個皮秒雷射，設備總體價格更高，而自發拉曼光譜儀普遍適用性更強。

73. 問：在細胞分選時，如何進行樣品搜索？是通過微流片中的單細胞通道嗎？每個細胞的曝光時間多少？如何控制曝光時細胞不移動呢？

答：在細胞分選過程中，我們是顯微鏡鏡下識別，可以通過形態、光譜等多個信號定位和識別。每個細胞的曝光時間根據細胞信號強度不等，在0.1-1秒就可採集一張拉曼光譜。控制細胞水層可以有效減少細胞移動，或者在細胞溶液中添加少量粘性物質。

答：螢光檢測需要細胞有自發螢光信號或者螢光標記，拉曼可以實現非標記、原位細胞檢測。

答：分選細胞前處理非常簡單方便，根據細胞大小將其稀釋到我們設備建議濃度就行，也建議上樣前將細胞清洗，去除雜質汙染。

76. 問：您測到的分選細菌，微生物的拉曼本徵圖譜，空間解析度很多少？

答：針對微生物應用，可使用532nm激發光，細胞的光譜空間解析度為該波長光學衍射極限。

長春長光辰英生物科學儀器有限公司（HOOKE INSTRUMENTS LTD）成立於2017年，是由牛津大學歸國李備博士團隊、中科院長春光機所及自然人等投資創立的高新技術企業。辰英科儀致力於應用光學技術解決生物學、醫學問題，研發與製造具有國際領先水平的生物醫療儀器。被評為國家高新技術企業、吉林省拉曼技術工程研究中心、吉林省博士後創新實踐基地。

長光辰英科儀核心產品為單細胞分選儀，可實現複雜生物樣本中單細胞的可視化、精準分選，具有無標記、非接觸、準確率高、廣泛適用等特點。公司可應用於生物醫學領域的其他產品還包括共聚焦拉曼光譜儀、生物拉曼檢測儀、超快共聚焦三維顯微成像系統等。

長光辰英科儀服務於基礎科研與臨床醫學研究，為探索生命科學提供強有力工具，為共同推動人類健康事業發展努力。

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開 放 投 稿：Light:Advanced Manufacturing

ISSN 2689-9620

期 刊 網 站：www.light-am.com

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☞ 來源：中科院長春光機所·Light學術出版中心聲明：本文所用視頻、圖片、文字如涉及版權問題，請第一時間告知，我們將根據您提供的證明材料確認版權並按國家標準支付稿酬或立即刪除.郵箱：[e-mail]

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