前沿顯微成像技術專題之:光片螢光顯微鏡 (1)

2020-12-07 Photometrics

在過去二十多年中，光學顯微成像技術發展迅速，不斷突破傳統極限。生命科學研究，要求成像系統在不影響生物活性的前提下，實現更大視野，更高解析度，更高速度的三維成像。這也意味著對成像探測器 - 科研相機的要求也越來越高。

從本周開始，我們將為大家帶來前沿顯微成像技術專題系列，和大家一起探討前沿的顯微成像技術以及他們對科研相機的相關性能要求。

首期我們的主角是近年來廣受關注和發展的光片螢光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy） 。

光片螢光顯微鏡的誕生

大家知道，傳統的寬場螢光顯微鏡通過物鏡將激發光聚焦，同時收集樣品的螢光信號成像。觀察其照明方式(圖1)不難發現，雖然焦平面上的光最強，但其上下的樣品也會被照亮，導致以下局限性：

引入額外的光毒性，影響樣品生物活性，甚至造成細胞死亡；成像焦平面以外的幹擾信號進入圖像，導致圖像解析度和反差降低。

圖1 寬場顯微鏡照明方式示意(Brad Amos, Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)

雷射掃描共聚焦使用點掃描方法，通過在探測端引入針孔，濾除了焦平面以外的雜散光，使解析度，特別是Z軸方向的解析度得到了提升，能夠實現三維成像。但是，當激發光聚焦時，仍然會照亮上下區域（圖2）。由於使用點掃描方式成像，為達到較快光的速度，光束照射每個點的時間很短，成像元件（PMT）的量子效率又很低，需要更強的激發功率。與傳統寬場螢光顯微鏡相比，光漂白和光毒性更加嚴重。

圖2 雷射掃描共聚焦照明方式示意：左圖（單點被照亮時）右圖（掃描成像）(Adapted from Brad Amos, Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge)

1990年發明的雙光子雷射掃描顯微鏡是減少光毒性的一個好方法。由於使用近紅外雷射照明，對活體樣品的光毒性大大降低，並且能夠穿透更深的樣品。但是，雙光子的信號很弱，採集速度非常慢，不適合對大樣品進行動態成像。而且其昂貴的成本也限制了應用範圍。

聽起來要同時滿足大視野，高解析度，高速度和低的光損傷是一件令人頭禿的事，不過這是難不倒科學家們的。

事實上早在1903年，席格蒙迪（Richard Zsigmondy）和西登託夫（Henry Siedentopf）就發明了通過一個狹縫生成光片照明的超顯微鏡(Ultra microscope)，但是他們的方法並未進一步發展到螢光成像。

直到1993年，華盛頓大學Voie和他的同事提出了正交平面螢光切片技術 (Orthogonal Plane Fluorescence Optical Sectioning，OPFOS)。

2004年，Ernst Stelzer和同事進一步發展了這個idea，搭建出一臺新的螢光顯微鏡，他們稱之為SPIM(單平面照明顯微鏡, Selective / Single Plane Illumination Microscopy)，也就是我們現在所知道的光片螢光顯微鏡。

什麼是「光片」？

光片顯微鏡與傳統顯微鏡的不同在於激發光的照明方式。它的照明光是一張與成像面平行的薄薄的「光片」(圖3)，只有焦平面的樣品被照亮，而其上下的樣品不受影響。

圖3 光片顯微鏡照明方式示意

和傳統螢光照明方式相比，光片照明有如下優點：

提高了圖像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和軸向解析度：光片照明技術保證了焦平面上下的樣品不會被激發，具備和共聚焦顯微鏡類似的光學切片功能；減少了光漂白和光毒性：與傳統的螢光照明技術相比，光毒性可以被降低20-100倍，這樣，我們就能在更接近生理狀態的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像；與雷射共聚焦和雙光子顯微鏡使用低QE的PMT的點掃描成像相比，光片顯微鏡使用高QE的CCD或sCMOS相機進行面成像，大大提高了成像速度和圖像的信噪比。共聚焦需要幾分鐘甚至幾小時才能拍完的樣品，用光片顯微鏡只需要幾秒到幾分鐘。因此，光片顯微鏡也特別適合用於大樣品成像。

在多數光片系統中，光學元件是固定的，需要移動樣品 (或使光片從xyz方向掃過樣品) 來獲得完整的3D圖像。通過移動或旋轉樣品，可以對大樣品進行成像，並從多個角度拍攝，將這些多視角圖像通過特別算法融合在一起後，能夠進一步提高圖像解析度，並修正一些光片技術特有的缺陷。

總之，光片螢光顯微鏡從設計原理上，大大降低了激發光對活體樣品的光毒性和光漂白，天生具有光學切片能力，使用高量子效率的CCD或sCMOS探測器，是大視野，高速，高解析度三維活體顯微成像的理想工具。

「光片」的實現

產生光片最簡單的方法是在光路中引入一個圓柱形透鏡。通過該透鏡的光，寬度維持不變，但在高度上被壓縮成平面 (圖4)，然後通過照明物鏡，在焦面上形成「光片」。成像物鏡垂直於照明物鏡放置，並聚焦在光片上獲取螢光信號。

圖4 圓柱形透鏡 (Edmund光學)

使用這種方法生成的光片，其寬度和厚度由照明物鏡的NA值決定。如圖5所示，照明光束的實際形狀是一個兩頭寬，中間細的「沙漏」形。ω0為光束腰厚度，也就是光片厚度，b為均勻照明寬度，也就是有效視野。

圖5 光片特性（箭頭指示激發光束的方向

有如下公式：

因此，使用NA較小的照明物鏡，能夠實現較寬範圍的均勻照明，即視野更大；但是相應的，光片的厚度也越大，導致軸向解析度降低。而高NA物鏡產生的光片視野會比較小，但軸向解析度較好。

要注意的是，如果成像物鏡的NA值很高，使得其景深小於光片的厚度，那麼系統的軸向解析度主要是由成像物鏡的景深決定。但這時會產生普通螢光照明時具有的問題，即焦面上下的部分樣品會被照亮，不必要的光毒性和雜散光會對成像效果產生負面影響。

如果成像物鏡的NA值較低，光片厚度比它的景深要小，那麼系統的軸向解析度就由光片的厚薄來決定。

好啦！說了這麼多，大家對光片顯微鏡是否有了一個基本印象了呢？什麼？有點抽象？別急，在後面幾期中，我們將為大家詳細介紹「光片」的各種實現方式和不同的光片顯微鏡應用，敬請期待！

References

Huisken J, Swoger J et al. (2004) Optical sectioning deepinside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. Aug 13;305(5686):1007-9

Huisken, J. & Stainier, D. Y. R. (2009) Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. Jun;136(12):1963-75.

VoieA. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. (1993) Orthogonal-plane fluorescenceoptical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biologicalspecimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36.

Weber M, Mickoleit M and Huisken J (2014) Light Sheet Microscopy. Methods in Cell Biology. Jan 01; 123:193-215.

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