光學顯微鏡的主要觀察方法之螢光觀察

2020-09-03 徠卡顯微系統

螢光現象

螢光是指螢光物質在特定波長光照射下，幾乎同時發射出波長更長光的過程(圖1)。當特定波長(激發波長)的光照射一個分子(如螢光團中的分子)時，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(S0)躍遷至較高的能級，即激發態(S1』)。這個過程稱為激發①。電子在激發態停留10-9–10-8秒，在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發態(S1)並回到基態的過程中③，會釋放出激發過程中吸收的剩餘能量。

螢光分子在激發態駐留的時間為螢光壽命，一般為納秒級別，是螢光分子本身固有的特性。利用螢光壽命進行成像的技術叫螢光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM)，可以在螢光強度成像之外，更加深入地進行功能性精準測量，獲取分子構象、分子間相互作用、分子所處微環境等常規光學成像難以獲得的信息。

螢光的另一個重要特性是Stokes位移，即激發峰和發射峰之間的波長差異（圖2）。通常發射光波長比激發光波長更長。這是由於螢光物質被激發之後、釋放光子之前，電子經過弛豫過程會損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的螢光物質更易於在螢光顯微鏡下進行觀察。


圖2：Stokes位移


螢光顯微鏡及螢光濾塊

螢光顯微鏡是利用螢光特性進行觀察、成像的光學顯微鏡，廣泛應用於細胞生物學、神經生物學、植物學、微生物學、病理學、遺傳學等各領域。螢光成像具有高靈敏度和高特異性的優點，非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動態過程的追蹤等等。

細胞中大部分分子不發螢光，想要觀察它們，必須進行螢光標記。螢光標記的方法非常多，可以直接標記（比如使用DAPI標記DNA），或利用抗體抗原結合特性進行免疫染色，也可以用螢光蛋白（如GFP，綠色螢光蛋白）標記目標蛋白，還可以用可逆結合的合成染料（如Fura-2）等。

圖3：Leica DMi8倒置螢光顯微鏡及濾片轉輪


目前螢光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標配成像設備，是我們日常實驗的好幫手。螢光顯微鏡主要分為三大類：正置螢光顯微鏡（適合切片）、倒置螢光顯微鏡（適合活細胞，兼顧切片）、螢光體視鏡（適合較大標本，如植物、斑馬魚（成體/胚胎）、青鱂、小鼠/大鼠器官等）。

螢光濾塊是顯微鏡螢光成像的核心部件，由激發濾片、發射濾片和二向分光鏡三部分組成，安裝在濾片轉輪裡，如Leica DMi8配有6位濾片轉輪（圖3）。不同的顯微鏡轉輪位數會有區別，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。

濾塊在螢光成像中起著重要作用：激發濾片選擇激發光來激發樣品，阻擋其他波長的光；通過激發濾片的光經過二向分光鏡（其作用是反射激發光和透射螢光），反射後通過物鏡聚焦，照射到樣品，激發出對應的螢光即發射光，發射光被物鏡收集，透過二向分光鏡，到達發射濾片。如圖4中：激發波長為450-490nm，二向分光鏡反射短於510nm的光、透過長於510nm的光，發射光接收範圍為520-560nm。

圖4：螢光顯微鏡光路圖


螢光顯微鏡常用螢光濾塊可分為長通（long pass，簡稱LP）和帶通（band pass，簡稱BP）兩種類型。帶通通常由中心波長和區間寬度確定，如480/40表示可通過460-500nm的光。長通濾色片如515 LP，表示可以通過波長長於515nm的光（圖5）。

圖5：FITC光譜曲線及濾片


螢光物質具有其特徵性激發（吸收）曲線和發射曲線，激發峰為最佳激發波長（激發效率最高，從而可以降低激發光能量，保護細胞和染料），發射曲線為發射螢光波長範圍。因此，在實驗中，我們會儘可能選擇與激發峰最接近的波長進行激發，而接收範圍需包括發射峰。如Alexa Fluor 488的激發峰為500nm，在螢光顯微鏡中可以選擇480/40的激發濾片。

圖6：Alexa Fluor 488光譜曲線


濾塊的詳細信息可以在顯微鏡成像軟體裡看到。了解染料並找到最匹配樣品的濾塊對於螢光成像有著至關重要的作用。螢光染料和螢光蛋白的光譜信息一般在說明書中會註明，也可在網上查閱（如https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/、https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-proteins-introduction-and-photo-spectral-characteristics/）。

濾塊的選擇除考慮螢光探針的激發、發射波長，對於多色標記樣品還需考慮是否有非特異激發、是否串色。此外還需考慮所使用的螢光光源，目前常用的螢光光源有汞燈、金屬滷素燈，以及近年來飛速發展的LED光源。螢光光源的光譜有連續的和非連續的，在不同波段能量也會不同。LED光源因為其相對較窄的光譜帶、更穩定的能量輸出、超長的壽命、更安全環保等諸多優點，正逐步成為螢光顯微鏡的主要光源。

除了顯微鏡內置的濾塊，還有外置快速轉輪（圖7），徠卡的外置快速轉輪相鄰位置濾片轉換速度為27ms，可實現高速多色實驗，如FRET及Fura2比例鈣成像（圖8）等。

圖7：徠卡外置快速轉輪EFW



圖8：鈣成像，Fura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats.


豐富多樣的螢光顯微成像技術

為了滿足不同的螢光成像需求，除螢光顯微鏡外，還發展出了各種螢光顯微成像解決方案：

Ø 寬場高清成像系統，如Leica THUNDER Imager，採用Leica創新的Clearing專利技術，在成像時高效去除非焦平面幹擾信號，呈現清晰圖像，同時兼有高速成像的優點；

Ø 共聚焦雷射掃描顯微鏡，利用針孔排除非焦平面幹擾，實現光學切片，得到高清圖像及三維立體圖像；

Ø 突破衍射極限的超高解析度顯微鏡及納米顯微鏡，可對小於200nm的精細結構進行觀察；

Ø 利用多光子激發原理進行厚組織及活體深層成像的多光子成像系統；

Ø 具有高時空解析度的光片成像技術，成像速度快、解析度高、光毒性低，特別適合進行發育、活體動態觀察等研究；

Ø 螢光壽命成像(FLIM），不受螢光物質濃度、光漂白、激發光強度等因素的影響，能更加深入地進行功能性精準測量；

Ø 螢光相關光譜(FCS)及螢光互相關光譜(FCCS），測量螢光分子的分子數、擴散係數，從而分析分子濃度、分子大小、粘性、分子運動、分子結合/解離、分子的光學特性等；

Ø 全內反射螢光顯微鏡(TIRF)，極高的z軸解析度，非常適合細胞膜表面的分子結構和動力學研究。

螢光顯微成像技術應用廣泛，種類豐富，而且新技術還在不斷湧現，大家可以選擇最適合的技術去完成自己的研究。

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