螢光顯微鏡的原理部件及其激發方式

　　螢光顯微鏡與普通光學顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）激發顯微鏡下標本內的螢光物質，使之發射螢光，所以，螢光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為一種激發標本的內螢光物質的能源。我們之所以能觀察標本，是由於光源的照明，而是標本內螢光物質吸收激發的光能後所呈現的螢光現象。

　　由此可知，螢光顯微鏡的特點，主要是它的光源能供給大量特定波長範圍的激發光，使受檢標本內的螢光物質能獲得必要強度的激發光。同時，螢光顯微鏡必須具備相應的濾光鏡系統。

　　螢光顯微鏡是免疫螢光組織化學的基本工具。它是由超高壓光源、濾片系統（包括激發和壓制濾板）、光學系統和攝影系統等主要部件組成，是利用一定波長的光激發標本發射螢光。

　　激發螢光的方式：按光的波長範圍分為UV激發法（使用紫外線照明法）和BV激發法（使用藍紫光）兩種。UV激發法是用短於400nm的近紫外光進行激發。該法不存在可見的激發光，所以被觀察的螢光呈現該染料固有的螢光，容易判別標本上的特異螢光和背景組織的自身螢光。

　　BV激發法是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍光進行激發。該方法使用藍光照射標本，所以螢光觀察系統的截止濾光片必須使用可完全阻斷藍光並可充分通過所需綠、黃螢光的濾光片。用於螢光抗體法的螢光色素。對於激發光的極大吸收波長和螢光的極大發光波長比較接近，所以BV激發法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍光作為激發光，所以螢光色素的吸收效率較高，可得到較明亮的圖像。其缺點是500nm以下的螢光無法看到，而500nm以上的使整個圖像顯黃色。在螢光抗體法中，大多以螢光色素特有的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時，上述BV激發法的缺點往往影響極大。

　　綜上所述，螢光顯微鏡的照明可根據聚光器的構造和激發光的波長按以下三點考慮。

　　①從螢光像的反差要求來看，UV激發暗場聚光器照明最好。

　　②以像的亮度來考慮，BV激發濾光片暗場觀察效率最高。

　　③UV激發濾光片暗場觀察和BV激發暗場聚光器照明的特性，可看作介於這兩種照明方法之間，但前者濾光片暗場的性質較強，顯示圖像較明亮，反差小；後者因保留暗場光路的性質，故顯示圖像較暗，而反差有所改善。當實際使用螢光顯微鏡時，應採用最適合標本要求的照明法進行觀察。

　　必須指出，即使像反差最佳的UV激發暗場聚光器照明，由標本折射或散射的部分紫外激發光也會進入物鏡，這樣在光學系統中的加拿大膠膠合面和光學玻璃因激發引起的自身螢光會使像的反應變壞。因此，必須在目鏡前面使用紫外吸收濾光片作為截止濾光片。