和很多偉大的科學發明一樣，雙光子顯微鏡的出現也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學尤其是神經科學帶來了一種革命性的成像技術：雙光子激發螢光顯微鏡。
有了想法後馬上實驗。借了一套染料飛秒雷射器，Denk聯合他的導師Watt Webb及其博士生James Strickler只用六個小時就完成了實驗搭建，採集數據則用了兩到三天，於是一篇裡程碑式的文章就此誕生了。
Winfried Denk谷歌學術頁面截圖
雙光子顯微鏡論文被引用超1萬次
Denk很快就將雙光子顯微鏡用於神經元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態後，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是，霍華德·休斯醫學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡，其成像視場達到5毫米，能夠跨多個腦區進行高速功能成像。根據清華大學單一採購來源的專家指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍。
30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚活體生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子，這種非線性成像技術通常也被統稱為多光子顯微鏡。下圖統計了自1990年以來每年發表的多光子顯微鏡文章數量，發展速度可見一斑。
在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過雷射激發樣品中的螢光標記，使用探測器測量被激發的螢光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合雷射器，通過單光子激發螢光，而雙光子使用飛秒雷射器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發螢光。下面是兩種技術的對比圖。
雙光子激發螢光的主要優勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有高強度聚焦點處能被激發，所以不會損傷焦平面之外的組織，並且生成更清晰的圖像。
雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主Maria Goeppert Mayer提出，30年後因為有了雷射才得到實驗驗證，但是到Winfried Denk發明雙光子顯微鏡又用了將近30年。
要理解雙光子的技術挑戰和飛秒雷射發揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當於和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決於聚焦光斑大小和雷射脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。
對於衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小隻和物鏡NA和雷射波長有關，所以關鍵變量只剩下雷射脈寬。基於以上分析，能夠以高重頻(100 MHz)輸出超短脈衝(100 fs量級)的飛秒雷射器成了雙光子顯微鏡的標準激發光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由於光強低無法被激發，所以雙光子成像更清晰。
Winfried Denk最初使用的光源是染料飛秒雷射器(100 fs脈寬、630 nm可見光波長)。雖然染料雷射器對於實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石雷射器。除了固態光源優勢，鈦寶石雷射器還具有較寬的近紅外波長調諧範圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調諧雷射器位於平臺最左邊。
科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，Chris Xu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那麼三光子看起來也是自然的發展方向。
三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的雷射脈衝，而傳統的鈦寶石雷射器難以達到這些要求，但是對於摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。
Y-Fi OPA放大器原理圖
Y-Fi OPA信號光規格
- 波長: 1275~1800 nm
- 脈衝寬度: 80 fs
- 平均功率: >1.5 W
- 脈衝能量: >0.4 μJ
- 可調重頻: 1~4 MHz
通過Y-Fi OPA和Bergamo顯微鏡的組合，Thorlabs能夠提供完整的三光子成像方案。