宗偉健:新一代微型雙光子螢光顯微鏡(多圖)

　　從石器時代原始部落的祭師對靈魂的崇拜，到中世紀後期哲人對大腦意識的產生溯源，到近代解刨學家發現井然有序的大腦功能分區，再到20世紀初Santiago Cajal得到了人類第一張清晰的大腦皮層神經元的照片，直至現在神經學家通過電生理，電子顯微鏡，光學顯微鏡等手段，在亞細胞，分子，基因水平對大腦的結構和功能進行研究，神經科學(neurosciences)這一門古老的學科，直至今日，仍然是全世界投入最大，最活躍的科學研究領域之一。

　　限制科學家去理解和探索大腦的最主要因素是技術。每一次神經領域的重大突破，都是以技術的一次次革命與飛躍作為基礎隨之而來。19世紀末高爾基染色和尼斯染色技術的發明，使得單個神經元的結構得意完整清晰的呈現，並由現代神經學之父聖地牙哥·拉蒙·卡哈爾(Santiago Ramon y Cajal,1852-1934)總結並開創了神經元理論，至今仍是現代神經科學的基礎。計算機體層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、經顱都卜勒(TCD)、單光子發射計算機斷層(SPECT)、正電子發射斷層掃描(PET)等無創性影像學技術的發展，使得人類對大腦整體水平結構和功能的認識不斷提高，並且對於大腦創傷和疾病的治療提供了有利的參考工具。在實驗神經科學領域，以模式動物作為研究對象，避免了把人作為研究對象在有創，改造等倫理方面的限制，使得更多的技術手段得以大顯身手。其中包括電生理學方面，腦電圖(EEG)，多電極記錄(MER)，膜片鉗技術(patch clamp)等技術的發明和有效使用，得以使科學家在亞微米空間尺度(單個神經突觸連接)，亞毫秒時間尺度(單次神經衝動電位)對神經元的功能進行研究。而最令人激動人心的是，近幾年來蓬勃發展的光學顯微成像技術，給實驗神經科學帶來了很多前所未有的思路和成果。2008年錢永健等人由於螢光蛋白(GFP，綠色螢光蛋白)的發現和使用，獲得了諾貝爾化學獎，是對螢光成像技術的一次巨大肯定和推動。光學成像本身具有高解析度、高通量(高速)、非侵入、非毒性等特點，再與螢光蛋白以及螢光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術相結合，使得科學家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內部不同結構與成分，並且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態下(活體狀態)對其功能進行動態觀察。這就使得螢光成像技術成為了無可替代的，生物學家現今最為重要的技術手段之一。而隨著近些年來各種新型的顯微技術的出現，共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)，相干拉曼成像(CARS)，超解析度顯微技術(super-resolution microscopy)，光片顯微技術(lightsheet microscopy)等使得螢光顯微鏡的解析度，速度，成像深度等進一步提高。

　　對於螢光成像技術在神經科學中應用，離不開雙光子螢光顯微鏡(Two-photon Microscopy，簡稱TPM)1。目前，大多數細胞生物學，生理學研究主要還是在離體培養的細胞體系中研究。然而與細胞生物學研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關鍵：僅研究分離的神經元無法解釋神經系統的功能和規律。換句話說，必須要求神經元處在其正常生存的大腦環境中才能使其正常運轉。然而，大腦是一個高度複雜的器官。即使是小鼠的大腦皮層也有將近1mm的厚度，海馬，丘腦等深腦區核團更是深達3-5mm2，而且並不透明，充滿了數以億計的神經元胞體和突觸，此外還有豐富的血管，黏膜(腦膜)，最外層還有厚厚的顱骨和頭皮包裹。使用包括共聚焦顯微鏡在內的傳統的螢光顯微鏡，由於被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡的發明，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學特性，再加上其工作波長處在紅外區域等特點，令其在生物體組織內的穿透深度大大提高3，使得雙光子顯微鏡成為神經科學家進行活體神經成像最理想的工具。神經動作電位(action potential)本身很難被光學信號捕獲，但是動作電位產生的去極化會引起神經元Ca2+濃度的變化(鈣內流現象)。科學家已經開發出多種Ca離子濃度的螢光探針，進而通過這種鈣離子濃度的變化引起的螢光信號的變化來反映出神經活動。於是，雙光子顯微鏡與在體的神經元Ca離子濃度指示劑標記技術相結合，碰撞出了耀眼的火花: 使得人們可以研究處於生理狀態時的動物大腦內的神經元活動4。

　　大腦的最重要功能是對生物體的行為活動進行調控，而反過來，最能反應大腦工作狀態的同樣是生物體的行為活動。所以說，為了了解大腦，研究者不僅要求在體狀態下對神經元進行高解析度觀測，而且也希望生物體在被觀測的階段裡，能夠進行正常的行為活動。所以，在成像技術不斷地提高解析度和速度等性能的同時，科學家們也在積極開改進和革這些成像技術手段，使其進行成像時儘可能小的限制被觀測對象的行為活動，以求得到最接近生理狀態下的數據。但是這一目標始終存在諸多的技術瓶頸: 以嚙齒類動物(大鼠或小鼠)神經元的雙光子鈣成像為例。早些年由於動物身體運動產生的晃動劇烈，而當時雙光子顯微鏡成像速度又很低，所以科學家只能在麻醉狀態下對頭部固定的動物進行成像。後來隨著成像速度的提高，並且對開顱手術技術的很大改進，使得科學家可以在清醒狀態下對動物的神經活動進行觀察(仍然需要頭部固定)。近些年來，隨著基因改造技術的突飛猛進，通過病毒轉染和轉基因技術，在神經元內源性表達「基因編碼類鈣指示劑(genetically encoded calcium indicator, 簡稱GECI)」成為神經元鈣成像的大趨勢4。這種由神經元自身產生鈣指示劑的方法與之前的鈣染料技術相比有著巨大的優勢: 信噪比提升了一個數量級;對神經元特異性好，可以區分不同的神經元類型;並且可以在大腦神經元內持續表達數月(病毒轉染)甚至整個生命歷程(轉基因動物)。於是，大概10年前開始，科學家就開始利用雙光子成像結合GECI技術對神經元的活動和結構變化進行長期的觀測和追蹤，從而對記憶的形成，神經元病變等問題有了更深入的認識。其中，現在性能最好，使用最為廣泛的GECI為綠色螢光鈣調蛋白Gcamp家族4。目前已經改進到第六代，Gcamp6f，Gcamp6f已經成為神經成像裡最受歡迎的指示劑之一。目前科學家最流行的對小動物行為過程中大腦活動進行成像的方法，是將虛擬實境與雙光子成像相結合，在動物頭部被固定的情況下，在其眼前製造影像，讓動物認為自己處在」真實「的環境之中5。通過小鼠四肢在類似跑步機或者滑鼠滾球上的運動來模擬其真實活動。以求達到研究神經元在動物行為中所起到的作用(如圖1)。

圖1 雙光子成像結合虛擬實境場景，對頭部固定，身體活動的動物進行研究。圖片來自⁵

　　然而，這種虛擬實境加頭部固定成像的方法，已經遭到許多科學家的質疑。人們認為，頭部固定的動物在實驗期間一直處在物理約束和情緒壓力下，因此無法證明神經元對外界的響應在虛擬實境和自由探索下是等價的。更重要的是，許多社會行為，比如親子護理，交配和戰鬥，都不能用頭部固定的實驗來研究。如何在動物自由活動的時候，直接對其神經元進行成像，是神經科學家還未能得到解決終極的訴求。

　　一個理想的解決方案是開發微型螢光顯微鏡直接固定在自由活動的動物身上，讓動物「帶著顯微鏡跑」6。這種嘗試大概從20年前開始。起初，科學家只是將一根或幾根光纖插到小鼠頭上，用以雷射導入和螢光信號採集。然而，這種方式而只是記錄某個區域內信號的總和，不具有空間解析度，算不上真正意義上的成像。在最近的十幾年裡，由於光學，電子，材料技術的發展，人們開始嘗試研製真正意義上的微型顯微鏡。其中，微型單光子寬場顯微鏡(miniature wide-field microscope)，由於其原理與結構相對簡單，是目前人們主要嘗試研製的微型顯微鏡技術。例如由Ghosh及其同事開發的顯微鏡，通過將小型LED光源，微型CCD和自聚焦透鏡整合到一個小於25px3的框架之中，研製出了一個重量為1.9g的微型寬場顯微鏡。該技術被用於研究大腦海馬區place cell等與記憶和本能相關的實驗當中7。然而，寬場成像方式由於不能很好的對離焦區域的背景信號進行過濾，並且對光的散射敏感，所以其無法達到細胞解析度。更難以對更精細的諸如樹突，軸突，樹突棘等結構進行觀察。所以一直難以達到神經科學家滿意。

　　於是，從大概15年前開始，世界上一些研究和開發雙光子成像技術的研究組開始嘗試將雙光子顯微鏡這種在神經成像領域已經獲得廣泛應用的技術進行微型。然而，目前只有為數不多的幾個課題組報導了他們在微型雙光子顯微鏡研製方面的進展: 在2001年，Denk等的工作被認為是研製微型雙光子顯微鏡的第一步8。然而，它仍然太過「巨大」(長7.5釐米，重25克)，而且成像速度很慢(2 Hz 128x128的尺寸下速度為2 Hz， 512x512的尺寸下為0.5 Hz，如圖2a)。之後，其他一些課題組相繼報導了不同的微型雙光子系統。 Helmchen課題組在2008年報導了他們的微型雙光子系統，僅重0.9克9。它實現了512X512幅面下的8 fps的成像速度速度，並展示了利用該系統實現的大鼠在體鈣成像信號。然而，從展示的效果來看，其空間解析度極低，而且並沒有實現真正的自由運動下的成像(如圖2b)。Mark Schnitzler課題組在2009年也發表了他們的微型雙光子系統10。他們的系統首次使用了微機電掃描鏡(MEMS)來進行掃描，並將Z聚焦模塊集成在了探頭之中(如圖2c)。但是掃描頻率仍然很低(400x135約為4Hz);空間解析度也遠遠達不到要求(橫向1.29 μm，軸向10.3 μm)。這些方面限制了其在神經元細胞核亞細胞水平成像中的應用。 Kerr課題組在2009年展示了它們的系統11，跟之前的微型雙光子顯微鏡相比較，由於應用了微型透鏡組構成的微型物鏡(NA達到了0.9)，這套系統的空間解析度更高。然而，這套探頭的重量也隨之提高(5.5g)。此外，由於其仍然使用振動光纖的方式來進行掃描，所以其成像速度仍然比較慢。(對於64x64為10.9Hz，對於理論上的512x512為1.25Hz)(如圖2d)。此外，還有一個之前所有的微型雙光子系統都沒有解決的問題。由於微型雙光子顯微鏡一般需要利用光纖將飛秒雷射導入到探頭之中，而光纖由於存在諸如色散、截至模式、導通帶寬等一系列限制，所以某一款光纖一般只允許一定帶寬(一般為幾十納米)和特定中心波長的光傳播。那就需要在製作微型顯微鏡的時候，結合使用的螢光指示劑所需要的雷射波長對光纖進行選擇。但是，目前商業化的，可以用來進行飛秒光傳輸的空心光子晶體光纖(hollow-core Photonic Crystal Fiber， HC-PCF)種類非常有限。例如，全球最大的光子晶體光纖生產商NKT公司僅提供中心波長為800nm，1030nm，1300nm和1550nm的HC-PCF。所有現有的微型雙光子顯微成像系統都是基於這幾款光纖所限定的中心波長進行開發的。但是很遺憾的是，本文上述所提到的目前最廣泛使用的GcamP指示劑需要920 nm的雷射進行激發。所以先前的所有微型雙光子都不能對Gcamp進行有效的成像。這限制了微型雙光子顯微鏡的發展。

圖2 微型雙光子發展史上的幾個典型工作。a、b、c、d分別選自參考文獻^8、9、10和¹¹

　　之所以這些早期的微型化雙光子顯微鏡都無法得到真正的使用和推廣，其原因在於，若要製造出具有實用價值的微型雙光子顯微鏡，比研製單光子微型顯微鏡複雜和困難的多得多。微型雙光子顯微鏡需要需要解決如下幾個關鍵技術難題：

　　1 如何將飛秒雷射有效的導入微型顯微鏡;

　　2 如何在微型顯微鏡內進行掃描/圖像重建;

　　3 如何在微型顯微鏡中進行高質量的雷射匯聚，高效激發雙光子信號。

　　4 如何有效的對螢光信號進行收集;

　　5 如何使整個系統在動物劇烈運動時仍保持穩定

　　6 在滿足前5項條件下，重量是否足夠輕，以致儘量小地對動物的活動造成影響;

　　本文作者所在的課題組，是由北京大學分子醫學研究所、信息科學技術學院、動態成像中心、生命科學學院、工學院聯合中國人民解放軍軍事醫學科學院組成跨學科團隊。我們在程和平院士的帶領下，在國家自然科學基金委國家重大科研儀器研製專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統》的支持下，歷經三年多的協同奮戰，成功研製了新一代高速高分辨微型雙光子螢光顯微鏡，並將其取名為FHIRM-TPM。原始論文於5月29日在線發表於自然雜誌子刊Nature Methods (IF 25.3)12。在這項成果中，我們解決了上文所提及的早先微型化雙光子顯微鏡研製中存在的問題，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經元和神經突觸活動清晰、穩定的圖像。

圖3 FIRM-TPM示意圖，來自¹²

　　新一代微型雙光子螢光顯微鏡體積小，重僅2.2克，適於佩戴在小型動物頭部，通過顱窗實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態信號。在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區的長時程觀測。相比單光子激發，雙光子激發具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優勢，所以成像質量遠優於目前領域內主導的、美國腦科學計劃核心團隊所研發的微型化寬場顯微鏡。其橫向解析度達到0.65μm，與商品化大型臺式雙光子螢光顯微鏡可相媲美;採用雙軸對稱高速微機電系統轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz(256*256像素)，同時具備多區域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。最為重要的是，FHIRM-TPM克服了先前限微型雙光子顯微鏡應用的兩個障礙。首先，我們定製設計的HC-PCF為 920納米飛秒雷射脈衝提供了無畸變傳輸，這種改進讓有效的激發例如Thy1-GFP和GCaMP-6f等常用螢光指示劑成為可能。第二，由於雙光子點掃描顯微鏡的高空間解析度和層切能力，安裝到動物頭上的微型雙光子顯微鏡非常容易受到運動偽影的影響。為了解決這個問題，我們對整個系統進行了充分的優化：(a)使用柔軟的新型光纖束SFB來使得動物運動引起的扭矩和拉拽力最小化，並不降低光子收集效率; (b)採用獨立的可旋轉連接器來連接光學探頭上的光纖和電線，以使動物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化;(c)使用高速成像以減少運動引起的幀內模糊。此外，我們在實驗之前預先訓練動物適應安裝在其頭骨上的微型顯微鏡，並滴加1.5%低熔點瓊脂糖使其充滿物鏡和腦組織之間，這些措施都顯著降低了探頭與大腦之間的相對運動，進而改善了實驗短期和長期的穩定性，於是實現了在動物進行包含大量身體和頭部運動的行為學試驗中中進行高解析度成像。

圖4 FIRM-TPM實物圖，來自¹²

　　樹突棘活動是神經元信息處理的基本事件，利用臺式雙光子顯微鏡在頭固定的動物上的研究表明單個神經細胞的不同樹突棘可以被不同朝向的視覺刺激或不同強度頻率的聲音刺激所激活。FHIRM-TPM實現了與傳統的大型的臺式雙光子顯微鏡相同的解析度和光學層切能力。與微型寬場顯微鏡相比，FIRM-TPM的高空間解析度，固有的光學切片能力和組織穿透能力以及相當的機械穩定性都是極有優勢的。所以雖然通過微型寬場顯微鏡可以獲得數百個神經元在細胞水平上的活動，但是我們的 FHIRM-TPM無疑提供了一個更加強大的工具，即在自由活動的動物中對更加基本的神經編碼單位——樹突棘的時空特性進行觀測。它能夠在對小鼠依次進行的行為學試驗(例如懸尾，跳臺，以及社交行為)的過程中長時間觀察位大腦中的神經元胞體、樹突和樹突棘的活動。這些功能的展示充分證明了FHIRM-TPM具有良好的性能和穩定性。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精準地操控神經元和大腦神經迴路的活動。微型雙光子螢光顯微鏡整機性能十分穩定，可用於在動物覓食、跳臺、打鬥、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學習前、學習中和學習後，長時程觀察神經突觸、神經元、神經網絡、遠程連接的腦區等多尺度、多層次動態變化。

圖5 三種模式在結構學成像中的成像質量對比，來自¹²

圖6 FHIRM-TPM在三種不同的行為學範例對小鼠大腦皮層神經元活動進行成像，來自¹²

　　從2001年Denk發表第一篇微型雙光子顯微鏡的原型機以來，微型雙光子顯微鏡的發展已經走過了15年的時間。15年的發展歷程，微型雙光子顯微鏡從最開始的25克笨重的身軀，只能在分離的組織中進行驗證性的實驗8到如今重量僅兩點幾克重，可以對自由活動的小鼠神經元進行樹突棘級別的成像，可以說取得了一定的進步。然而，在看到這個領域取得的成就的同時，也應看到，至今為止，微型雙光子顯微鏡還未像共聚焦顯微鏡或者是螢光光片顯微鏡一樣被生物學家廣泛認可和應用。而後者(光片顯微鏡)的發展時間更短(2008年Science的一篇文獻一般被認為是現代螢光光片顯微鏡鏡的開端13)。究其原因，除了技術本身的限制以外，整個研究領域的氣氛和投入，也是重要的影響因素之一。

　　縱觀這15年來微型雙光子顯微鏡的發展道路，開疆拓土者有之;改革創新者有之;另闢蹊徑者有之;渾水摸魚、指鹿為馬者亦有之。然而遺憾的是，願意心無旁騖、全情投入者鮮有之;有意願和能力建立為這個研究的領域建立範式者亦鮮有之。而中國，在不久前在這個領域基本上屬於完全的空白。更不要說什麼領先世界。

　　然而令人十分興奮的是，中國國家基金委國家重大科研儀器設備研製專項在2014年正式將「超高時空分辨微型雙光子在體顯微成像系統」立項。以5年七千兩百萬人民幣的研究經費對這一項「世界上做的還並不怎麼好，中國基本沒人做過」的技術進行攻關研發。這樣的大力投入無疑為這一領域注入了新鮮血液和十足動力。而我也有幸在博士五年期間全程參與了這個項目的工作。從2012年來到該項目首席負責人程和平院士和陳良怡研究員的聯合課題組至今，我見證了這個項目從無到有，團隊從幼小稚嫩到壯大成熟的整個過程。如今，我們有了初步的成果，不僅讓我們這樣一支完全由中國本國科研工作者建立的團隊在世界上處在了較為領先的位置，同時也把這個領域向前推動了一些，我感到無比激動和自豪。

　　該成果在2016年底美國神經科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告後，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內的國內外神經科學家的高度讚譽。冷泉港亞洲腦科學專題會議主席、美國著名神經科學家加州大學洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道，「從任何一個標準來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術發明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經元和樹突成像。系統神經生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的複雜生物學事件進行成像觀測，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環路實現複雜行為的核心工程學原理。毫無疑問，這項非凡的發明讓我們向著這一目標邁進了一步。」

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