雙光子顯微鏡是Winfried Denk教授在1990年博士後期間發明的，今年正好是雙光子顯微鏡面世30周年，目前Winfried Denk供職於德國海德堡馬克斯-普朗克神經所。雙光子顯微鏡通常可提供約10–30 Hz的幀採集速率，通俗一些來說每秒鐘可採集10-30個圖像，速度較慢，這就限制了其使用。
科研人員一直試圖通過多種方式提高雙光子成像速度，主要分為三類：第一類通過聲光成像掃描技術開發的雙光子隨機掃描技術，將成像速度提高到千赫茲速率，實現毫秒級的光學記錄，可對細胞膜電壓進行記錄，但是犧牲了解析度。
第二種最常見的提高成像速度的方法是將視角分為若干個子區域，並使用多個光束同時掃描這些子區域。已有研究採用四個光束同時進行掃描，其掃描速率高達250 Hz。
第三類就是最新出現的達到千赫茲採樣速率，也是我們今天要講的主題，千赫茲雙光子顯微鏡成像技術。
2020年3月2日Nature Methods雜誌加州大學物理系Na Ji教授（中國科學技術大學畢業後到加州大學伯克利分校深造）和香港大學Kevin K. Tsia 教授聯合研究團隊利用千赫茲雙光子顯微鏡實現動態快速檢測神經元活動。
關於千赫茲雙光子顯微鏡成像爆發式研究主要在2019年，主要在cell、Nature Methods頂級雜誌上發布，儘管都屬於千赫茲雙光子顯微鏡，但是採用的技術都不盡相同。
首先是2019年8月霍華德·休斯醫學院Kaspar Podgorski 研究團隊發明了SLAP (scanned line angular projection)成像新技術，該顯微鏡從四個不同角度掃描二維樣本平面上的線焦點，同時這些線焦點的解析度可以保持雙光子成像中的點焦點的高解析度，這樣的話可以實現1016HZ的幀速度完成對250um*250um的大視野三維成像。
同年11月史丹福大學Mark J. Schnitzer教授通過另外一種方式——他們設計了具有400個照明光束實現千赫茲高速成像。
在本文中Kevin K. Tsia 教授通過自主研發的脈衝展寬技術也能實現雙光子顯微鏡的快速成像。
普通螢光團的螢光壽命約為3 ns，這個時間是將信號準確的分配給掃描位置所需的最短停留時間，而常規雙光子顯微鏡每個像素的停留時間大概在0.1-40us之間，這個時間明顯大於螢光壽命。為了能夠將像素停留時間很好的控制在螢光壽命內，研究人員將自由空間角度啁啾增強延遲（FACED）成像技術應用到雙光子顯微鏡中實現了千赫茲高速成像。
FACED成像是由Kevin K. Tsia 教授在2016年開發的，該技術實質上是一種脈衝展寬技術，在可見波長區域實現超快速雷射掃描時間拉伸成像。簡單的來說，用圓柱透鏡將雷射脈衝束聚焦在一維平面內並獲得一定會聚角，然後再將光束髮射到一對間距為S，偏心角為α，幾乎平行的高反射鏡中，在鏡子多次反射之後，雷射脈衝被分成傳播方向不同的多個子脈衝 。這些子脈衝以一定的時間間隔進行回射。這些子脈衝隨後通過輸出設備輸送到物鏡上，形成一組空間上分隔且時間延遲的焦點，從而實現線掃描。
FACED示意圖，圖片來源於
Ultrafast laser-scanning time-stretch imaging at visible wavelengths 2016 Light:Science&Application
研究人員將FACED模塊加裝到常規雙光子顯微鏡中，稱為FACED-2PFM，在1 MHz重複頻率的920nm波長激發光中產生80個焦點，這些焦點間隔為每微秒50μm，最終可以在0.001秒內實現每幀畫面包含80×900像素的高速成像速度。
了解大腦中的信息處理需要以高時空解析度監視神經元活動。神經細胞的活動主要表現為細胞膜電位的去極化和超極化。電壓敏感染料可以將神經細胞膜的電位變化轉化為螢光強度的變化,可以高時間解析度(ms)記錄神經細胞的活動情況。
向小鼠初級視覺皮層注射基因編碼的電壓指示劑ASAP3後利用FACED-2PFM觀察該部位膜電壓變化情況。但是研究人員發現以1000HZ連續成像6秒明顯的形成光漂白，不利於成像。為了減少光漂白作用，他們改變了成像策略，在1秒內完成1000HZ的成像，然後「休息」2.5秒，這樣可以使螢光得到恢復，有利於重複成像。最終可以實現對不同深度同一神經元的細胞膜電壓進行成像。
其實FACED-2PFM可以更快，研究人員通過改變y振鏡的掃描速度，可以實現在0.00033秒（三千分之一秒）內實現每幀畫面包含80×1200像素的高速成像速度.也就是說在1秒鐘內可以拍攝3000張80×1200像素的照片。
同時我們也要主要到一個問題，儘管FACED-2PFM實現了高時間解析度，但是犧牲了空間解析度，這兩者並不能兼得。80×1200像素是什麼概念呢？按照電視電影行業制定的標準,最低的高清視頻為1280×720，標清視頻一般為480×720。所以無論80×900像素還是80×1200像素的照片，都不算清晰，有些模糊。
總的來說，本文通過自主研發的FACED技術可以明顯提高雙光子顯微鏡成像速度，實現亞細胞水平檢測神經元活動。看來下一代雙光子顯微鏡，需要解決空間解析度的問題了。
參考文獻：
1.Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes
2. Kilohertz frame-rate two-photon tomography
3. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice
4.Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo
5.Ultrafast laser-scanning time-stretch imaging at visible wavelengths
6.Wide. Fast. Deep: Recent Advances in Multiphoton Microscopy of In Vivo Neuronal Activity
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