對於顯微成像技術包含：寬場螢光顯微鏡、雷射共聚焦顯微鏡、轉盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、全內反射螢光顯微鏡等多種成像方式，每種成像方式都有他的優缺點。大家最熟悉就是雷射共聚焦顯微鏡了。想必大家對於雷射共聚焦顯微鏡都不陌生吧，雷射共聚焦能給我們展現清晰的圖像。
寬場螢光顯微鏡成像（a，c，e ）與共聚焦顯微鏡成像(b，d, f )
共聚焦顯微鏡成像
共聚焦顯微可以呈現這麼漂亮的圖像，是不是什麼樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的，任何事物都有優缺點，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內的的樣品，對於厚的或者活體樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由於是逐點進行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的，特別是拍攝活細胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由於光照射的區域幾乎能通過這個Z軸的層面，所以對於空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確；並且雷射共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發，對於一些特殊激發波長的實驗，效率非常低。
共聚焦顯微鏡的一些限制
那麼如何解決以上這些困擾呢，雙光子顯微鏡就應運而生了。雙光子顯微鏡是怎麼回事呢，那就讓我們來了解下吧。我們先來了解一下雙光子顯微鏡的基本原理：
雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，螢光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間後，發射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發螢光分子是相同的。雙光子激發需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈衝雷射器。這種雷射器發出的雷射具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈衝寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達到 80至100兆赫茲。在使用高數值孔徑的物鏡將脈衝雷射的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了螢光檢測效率。
a共聚焦成像聚焦點，b雙光子顯微鏡成像聚焦點。
從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優點：
☆ 光損傷小：由於雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發光源，這一波段的光對活體細胞和組織的光損傷小，適用於長時間的研究；
☆ 穿透能力強：相對於紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；
☆ 高解析度：由於雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區域內可以激發出螢光，雙光子吸收僅局限於焦點處的體積約為波長3次方的範圍內；
☆ 漂白區域小：由於激發只存在於交點處，所以焦點以外的區域都不會發生光漂白現象；
☆ 螢光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦針孔），這樣就提高了對螢光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高；
☆ 圖像對比度高：由於螢光波長小於入射波長，因而瑞利散射產生的背景噪聲只有單光子激發時的1/16，大大降低了散射的幹擾；
☆ 光子躍遷具有很強的選擇激發性，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究；
☆ 避免組織自發螢光的幹擾，獲得較強的樣品螢光：生物組織中的自發螢光物質的激發波長一般在350~560nm範圍內，採用近紅外或紅外波段的雷射作為光源，能大大降低生物組織對激發光吸收；
雙光子顯微鏡有這麼多優點，那麼雙光子顯微鏡有哪些應用呢。讓我們來了解一下：
這張圖可以代表雙光子顯微鏡的大部分應用。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在活體小鼠的的任何部位進行活體成像。目前我們平臺已經可以成功進行小鼠的耳朵、腦、血管、神經、心臟、肝臟、肺、腫瘤、眼睛、腹腔、腹股溝、皮膚等大部分位置的實驗，並且取得了相對滿意的結果。
平臺實驗案例展示
除了這些應用之外呢，雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細胞進行特定實驗，還有一些短波長（eg 300多激發波長的樣品，）可以利用雙光子特性進行特定實驗。下面我們一起來看下應用案例：
對小鼠進行不同處理後進行活體成像，研究小鼠記憶功能
細胞在特殊厚的材料裡的高分辨成像
合成探針材料尾靜脈注射，通過靶向到達腫瘤
以上就先簡單給大家介紹這些吧，更多詳細信息及問題歡迎隨時聯繫我們哦！
參考資料：
Masters, Barry R. . "Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition." Journal of Biomedical Optics 18.2(2013):29901.
Xie, H., et al. "In vivo imaging of immediate early gene expression reveals layer-specific memory traces in the mammalian brain. " Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111.7(2014):2788.
Lv, Yanlin , et al. "Cancer Cell Membrane-Biomimetic Nanoprobes with Two-Photon Excitation and Near-Infrared Emission for Intravital Tumor Fluorescence Imaging." Acs Nano 12.2(2018):1350-1358.
平臺基本信息：
圖像處理工作站（Imaris 9.2.1、Image pro premier 3D 9.2、AutoQuant、Huygens 18.04、Voloom、Nikon NIS-Elements Analyzer）
轉盤共聚焦顯微鏡活細胞工作站(Spinning Disk )
Deltavision長時程活細胞工作站(Delta Vision)
雷射共聚焦顯微鏡(Confocal)
全內反射螢光顯微鏡(TIRF)
雙光子顯微鏡( FV1000MPE-M)
螢光相關光譜-螢光壽命成像顯微鏡(FLIM-FCS)
結構化照明顯微鏡差（SIM）
超高解析度顯微鏡（STORM）
雷射顯微切割
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