角膜提供了眼睛的大部分折射能力，由5層組成（圖1），從外到內依次是上皮層，鮑曼層、基質、角膜後彈力層（間質膜）、內皮層。
圖1 角膜的組織學結構上皮層負責阻擋異物落入角膜，厚約50μm，由三種細胞構成，從外到內依次是表層細胞、翼細胞和基底細胞。只有基底細胞可進行有絲分裂和分化，基底細胞的補充是由從角膜邊緣的幹細胞完成的。翼細胞由基底細胞分化而來，處於中度分化狀態，形狀像羽翼。表層細胞完全分化，不斷脫落。基底細胞下方有一層基底膜，由基底細胞分泌而來。
鮑曼層是一層無細胞結構的薄膜，厚8~12μm，主要成分為雜亂交織的膠原蛋白纖維。
基質厚約450μm，佔角膜厚度的90%，是維持角膜形狀、強度和透明性的主力，由規則分布的膠原蛋白纖維、基質細胞和基質外成分構成。基質結構中，長度和直徑均一的膠原蛋白平行分布，構成片晶結構，多個片晶製成起整個基質。基質細胞通過合成膠原蛋白和基質外成分對基質進行保養和再生。基質部分通過水合作用對角膜的含水量進行調控。
角膜後彈力層（間質膜）是內皮層的基底，由膠原分子和糖蛋白構成，厚度隨年齡增大而增長，新生兒厚約3~5μm，老年人厚約10~15μm。
內皮層厚5μm，由單層多角細胞構成，代謝水平高，負責抽運水分子，調控角膜的水合作用。
角膜的生理學基礎主要介紹營養供給與氧氣供給。角膜獲得營養物質是通過眼房水和邊緣的毛細血管獲得，而氧氣是通過淚膜中的擴散獲得。角膜在睜眼時有氧呼吸產生ATP供能，睡眠時無氧呼吸產生ATP供能。當角膜發生病變時會影響角膜的代謝方式。
傳統成像方式有裂隙燈顯微成像，共焦距顯微成像和光學相干斷層掃描成像（OCT）三種。裂隙燈顯微成像由雙目望遠鏡和長、寬、入射角可調的光源組成，最早應用於角膜成像中，但無法獲得細胞層面的信息。共焦距顯微成像使用小孔濾去焦距外的信號，可獲得細胞解剖學和密度信息，但無法獲得代謝信息。OCT成像速度快，可獲得角膜層次結構信息，成像深度大，但無法獲得代謝信息。
雙光子顯微成像成像深度大，解析度在亞細胞水平，可獲得細胞代謝和基質結構的信息。細胞代謝信息可通過對細胞內源性分子（如NAD(P)H和FAD）螢光成像獲得（圖2，其中紅色為NAD(P)H，綠色為FAD），基質結構信息可通過膠原蛋白纖維的二次諧波產生獲得。
圖2 雙光子螢光對角膜細胞結構成像 [1]內源分子的種類可通過螢光的光譜、強度、螢光壽命進行分辨，雙光子成像有雙光子螢光強度成像、雙光子螢光壽命成像和二次諧波產生成像三種。在強度成像中，同種分子不同的氧化還原狀態信號不同，反應了新陳代謝信息。在螢光壽命成像中，同種分子處在不同微環境時所發螢光的持續時間不同，據此可判斷其是否與蛋白質結合，從而判斷代謝狀態。二次諧波成像中，近紅外雷射可激髮膠原蛋白產生二次諧波，獲得基質層結構信息。
雙光子顯微成像系統由鈦寶石近紅外光源、3維掃描組塊，光展寬器、衰減器、顯微物鏡和光電倍增管構成，有5D雷射掃描顯微鏡（圖3）和多光子斷層掃描儀MPTflex兩種裝置。
圖3 雙光子顯微成像設備示意圖 (a) 5D雷射掃描顯微鏡 (c)MPTflex [1]圖4使用多光子斷層掃描儀MPTflex 獲得，展示了線粒體較少的上皮層表層細胞（圖4(a)，圖4(b)），線粒體中等的翼細胞（圖4(c)），線粒體較多且集中在細胞核附近的基底細胞（圖4(d)）,鮑曼層存在基底細胞（圖4(e)，圖4(f)的紅色）和膠原蛋白（綠色），基質層存在豐富的膠原蛋白（圖4(g)，圖4(h)的綠色）和少量基質細胞（箭頭），角膜後彈力層內源螢光信號強（圖4(i)），但膠原蛋白的無規則分布阻礙了二次諧波產生，內皮層線粒體密集（圖4(j)）。
圖4 多光子斷層掃描儀MPTflex對細胞不同層次形態成像 [1]而使用二次諧波成像可獲得基質層膠原蛋白結構（圖5）。
圖5 二次諧波對基質部分膠原纖維的成像 [1]雙光子成像可對角膜上皮層進行形態學和新陳代謝分析（圖6），來進行角膜移植前的評估。其中主要評估的是角膜內皮層的細胞密度狀態，除此之外還可以通過代謝狀態分析內皮層病理學狀態。雙光子成像還可以分辨角膜疾病，圖7為角膜上皮層成像，其中(a)為正常角膜，(b)為圓錐形角膜，(c)為棘阿米巴角膜炎，細胞形態有明顯變化。圖8為無病理及患有圓錐角膜及棘阿米巴角膜炎角膜基質的二次諧波成像，(a)為正常角膜，(b)為圓錐形角膜，(c)為棘阿米巴角膜炎，病理組織的二倍頻信號異於正常組織。
圖6 多光子顯微鏡對角膜進行角膜移植前評估 [1]圖7 無病理組織(a)，圓錐角膜症組織(b)及棘阿米巴角膜炎組織(c)的雙光子形態學成像 [1]圖8 無病理組織(a)，圓錐角膜症組織(b)及棘阿米巴角膜炎組織(c)的二倍頻成像 [1]眼角膜病變是致盲的重要原因，傳統成像方法（如裂隙燈顯微成像、共焦距顯微成像、光學相干斷層掃描成像）無法對活體角膜細胞成像，獲得有關細胞的代謝水平和角膜基質組織結構的信息。雙光子成像通過激發內源特異性螢光和二次諧波，獲得角膜細胞形態、新陳代謝狀況和基質結構的信息，從而可以在角膜移植和病理診斷中發揮重要作用。
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參考文獻：
[1] König, Karsten. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging [M].