摘 要 雷射掃描共聚焦顯微鏡是近十年發展起來的醫學圖象分析儀器，現已廣泛應用於螢光定量測量、共焦圖象分析、三維圖象重建、活細胞動力學參數監測和胞間通訊研究等方面。其性能為普遍光學顯微鏡質的飛躍，是電子顯微鏡的一個補充。本文以美國Meridian公司的ACAS ULTIMA312為例簡要介紹了雷射掃描共聚顯微鏡系統的結構，功能和生物學應用前景。
關鍵詞 雷射；共聚焦顯微鏡；粘附細胞分析與篩選（ACAS）
雷射掃描共聚焦顯微鏡（Laser scanning Confocal Microscopy ，簡稱LSCM）是近代生物醫學圖象儀器的最重要發展之一，它是在螢光顯微鏡成象的基礎上加裝雷射掃描裝置，使用紫外光或可見光激發螢光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的螢光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。已廣泛應用於細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等領域[1、2、3]，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優越性，為這些領域新一代強有力的研究工具。
創建於1983年的美國Meridian公司，在90年代推出的「雷射掃描共聚焦顯微鏡」這一項具有劃時代的義意的高科技產品，曾獲得美國「政府新產品獎」和兩次「高科技領先技術獎」，它能達到每秒120幅畫面的高速掃描雷射共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的雷射共聚焦原色圖象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技產品，為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。現以該儀器為例介紹雷射掃描共聚焦顯微鏡系統及其在細胞生物學中的應用。
1、雷射掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成
有關共聚焦顯微鏡的某些技術原理，早在1957年就已提出，二十年後由Brandengoff在高數值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡[5]，1985年Wijnaendts Van Resandt發表了第一篇有關雷射掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章，到了1987年，才發展成現在通常意義上的第一代雷射掃描共聚焦顯微鏡。
雷射掃描共聚焦顯微鏡成像原理如圖1所示，雷射器發出的雷射束經過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉90度，經過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的螢光物質在雷射的激發下發射沿各個方向的螢光，一部分螢光經過物鏡、長通分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。
從圖1中可以看出，只有在物鏡的焦平面上發出的螢光才夠到達檢測器，其它位置發出的光均不能過針孔。由於物鏡和會聚透鏡的焦點在同一光軸上，因而稱這種方式成像的顯微鏡為共聚焦顯微鏡為共聚顯微鏡。在成像過程中針孔起著關鍵作用，針孔直徑的大小不僅決定是以共聚焦掃描方式成像還是以普遍學顯微鏡掃描方式成像，而且對圖像的對比度和解析度有重要的影響。
ACAS ULTIMa 312採用快速鏡掃描或臺階掃描對樣品逐點掃描成像，由於樣品中不同的掃描點始終在物鏡和會聚透鏡的光軸上，因而它以相同的信噪比掃描整個樣品，掃描精度達0.1μm，掃描面積最大的為10cm×8cm，當雷射逐點掃描樣品時，針孔後的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，並將之轉化為數位訊號傳輸至計算機，最終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚聚焦圖像。一個微動步進馬達控制栽物臺的升降，使焦平面依次位於標本的不同層面上，可以逐層獲得標本相應的光學橫斷面的圖像。這稱為「光學切片」。再利用計算機的圖像處理及三維重建軟體。可以得到高清晰度來表現標本的外形剖面，十分靈活、直觀地進行形態學觀察。
2、雷射掃描共聚焦顯微鏡硬體和軟體系統
2.1 ACAS ULTIMa 312硬體及參數指標 雷射光源：氬離子雷射（50mW的紫外光、999 mW的可見光），能同時/順序/分別輸出紫外光和可見光，激發波長為351-364nm；488nm；514nm。 計算機系統：80586/133MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬碟/150MB Bernoulli盤驅動器/17』』大屏幕顯示器。 共聚焦系統：計算機自動控制光路準調節；計算機控制孔徑校準；計算機調節孔徑大小；自動Z軸調節（最小0.1μm）。 光學探測系統：3個測窗式PMT採集螢光；1個CCD系統；12位的高速A/D轉換器。 圖像解析度：圖像大小1535×1535；像素最小距離：0.1μm；灰度為4096級。 掃描方式：快速鏡掃描Dual Scan臺階掃描；掃描精度0.1μm；掃描面積最大為10cm×8cm ；掃描平面：XY和XZ和獨特點、線、面掃描。2.2雷射掃描共聚焦顯微鏡軟體系統
ACAS ULTIMa 312系統採用獨特設計的軟體將雷射細胞儀與先進的計算機技術結合，產生快速、高效、靈活的作業系統，完備的數據採集、分析與管理功能。基於生物醫學研究有如下的軟體。
Image Analyze―對於單色、比色和三色標記的二維螢光圖像的定量分析，可產生透射光圖像重疊，同時Auto Image可多個區域的自動掃描和螢光定量，以及相同區域的時間順序掃描。 Ratio Analysis和 Kinetics―測定細胞內的離子變化，可有點掃描、線掃描及圖像掃描三種測定形式，以監測各種速率的生物反應。 Cell ?CCell Communication and FRAP-相鄰細胞的FRAP分析。該軟體首先用可光淬滅特異的細胞螢光，然後在多個時間點掃描，此掃描可對單一區域或細胞的多個選擇區域，可產生透射光圖像並與其它圖像重疊。 Cell List―儲存被選擇細胞的位置，即可自動對較大樣品進行掃描，又可產生較小樣品特異部位的網絡位置表，以進行自動的測量、篩選和重複測定。 Cell Sorting―ACAS具備如下四種分選方式： Ablation Sort:預選定義一個螢光閾值 ，然後對特定細胞殺傷。②CookieCutter Sort在用戶定義的中心點四周切割Cookies。③Quick Sort：對已定義的細胞表列，用Ablation或Cookie Cutter作分選。④Manual Sort：直接使用滑鼠控制載物臺位置及雷射脈衝，並殺滅和分選細胞，進行細胞顯微外科，染色體切割和光隱阱等操作。 Confocal Imaging―共聚焦分析，可實現Z軸定量，三維立體圖像分析（包括SFP模擬螢光處理法，DP深度投影法和SP文體投影法），以及視點移動動畫。
3 雷射掃描共聚焦顯微鏡在細胞生物學中的應用
3.1 定量螢光測量
ACAS可進行重複性極佳的低光探測及活細胞螢光定量分析。利用這一功能既可對單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、成份及分布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結合等生化反應程度。此外，還適用於高靈敏度快速的免疫螢光測定，這種定量可以準確監測抗原表達，細胞結合和殺傷及定量的形態學特性，以揭示諸如腫瘤相關抗原表達的準確定位及定量信息。
3.2 定量共聚焦圖像分析
藉助於ACAS 雷射共焦系統，可以獲得生物樣品高反差、高解析度、高靈敏度的二維圖像。可得到完整活的或固定的細胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建後可以揭示亞細胞結構的空間關係。能測定細胞光學切片的物理、生物化學特性的變化，如DNA含量、RNA含量、分子擴散、胞內離子等，亦可以對這些動態變化進行準確的定性、定量、定時及定位分析。
3.3 三維重組分析生物結構
ACAS使用SFP進行三維圖像重組，SFP將各光學切片的數據組合成一個真實的三維圖像，並可從任意角度觀察，也可以藉助改變照明角度來突出其特徵，產生更生動逼真的三維效果。
3.4 動態螢光測定
Ca2+ 、pH 及其它細胞內離子測定，利用ACAS能迅速對樣品的點，線或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發射和三發射光比率，使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種螢光探針對各種離子作定量分析。可以直接得到大分子的擴散速率，能定量測定細胞溶液中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應，以及使用雙螢光探針Fluo-3和CNARF進行Ca2+和pH的同時測定。
3.5 螢光光漂白恢復（FRAP）--活細胞的動力學參數
螢光光漂白恢復技術藉助高強度脈衝式雷射照射細胞某一區域，從而造成該區域螢光分子的光淬滅，該區域周圍的非淬滅螢光分子將以一定速率向受照區域擴散，可通過低強度雷射掃描探測此擴散速率。通過ACAS可直接測量分子擴散率、恢復速度，並由此而揭示細胞結構及相關的機制。
3.6 胞間通訊研究
動物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用於測定相鄰植物和動物細胞之間細胞間通訊，測量由細胞縫隙連接介導的分子轉移，研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用，以及胞內Ca2+ ,PH和cAMP水平對縫隙連接的調節作用。
3.7 細胞膜流動性測定
ACAS設計了專用的軟體用於對細胞膜流動性進行定量和定性分析。螢光膜探針受到極化光線激發後，其發射光極性依賴於螢光分子的旋轉，而這種有序的運動自由度依賴於螢光分子周圍的膜流動性，因此極性測量間接反映細胞膜流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點，溫度反應測定和物種比較等方面有重要作用。
3.8 籠鎖―解籠鎖測定
許多重要的生活物質都有其籠鎖化合物，在處於籠鎖狀態時，其功能被封閉，而一旦被特異波長的瞬間光照射後，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞的增值、分化等生物代謝過程中發揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照射波長和時間，從而達到人為控制多種生物活性產物和其它化合物在生物代謝中發揮功能的時間和空間作用。
3.9 粘附細胞分選
ACAS是目前唯一能對粘附細胞進行分離篩選的分析細胞學儀器，它對培養皿底的粘附細胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司專利技術，首先將細胞貼壁培養在特製培養皿上，然後用高能量雷射的欲選細胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細胞則因在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用於選擇數量較少諸如突變細胞、轉移細胞和雜交瘤細胞，即使百萬分之一機率的也非常理想。（2）雷射消除法，該方法亦基於細胞形態及螢光特性，用高能量雷射自動殺滅不需要的細胞，留下完整活細胞亞群繼續培養，此方法特別適於對數量較多細胞的選擇。
3.10 細胞雷射顯微外科及光陷阱技術
藉助ACAS可將雷射當作「光子刀」使用，藉此來完成諸如細胞膜瞬間穿孔、切除線粒體、溶酶體等細胞器、染色體切割、神經元突起切除等一系列細胞外科手術。通過ACAS光陷阱操作來移動細胞的微小顆粒和結構，該新技術廣泛用於染色體、細胞器及細胞骨架的移動。
4、結語
雷射掃描共聚焦顯微鏡是近十年發展起來的醫學圖像分析儀器，與傳統的光學顯微鏡相比，大大地提高了解析度，能得到真正具有三維清晰度的原色圖象。並可探測某些低對比度或弱螢光樣品，通過目鏡直接觀察各種生物樣品的弱自發螢光。能動態測量Ca2+ 、pH值，Na1+、Mg2+等影響細胞代謝的各種生理指標[9]，對細胞動力學研究有著重要的意義。同時雷射掃描共聚顯微鏡可以處理活的標本，不會對標本造成物理化學特性的破壞，更接近細胞生活狀態參數測定。可見雷射掃描共聚焦顯微鏡是普遍顯微鏡上的質的飛躍，是電子顯微鏡的一個補充，現已廣泛用於螢光定量測量，共焦圖像分析，三維圖像重建、活細胞動力學參數分析和胞間通訊研究等方面，在整個細胞生物學研究領域有著廣闊的應用前景。