來源：來源網絡 2006-12-16 23:27
l 樣品要求：
1.經螢光探劑標記(單標、雙標、三標）
2.固定的或活的組織
3.固定的或活的貼壁培養細胞(Confocal專用小培養皿，蓋玻片)
4.懸浮細胞，甩片或滴片後，用蓋玻片封
一. 組成
倒置或直立螢光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、螢光濾片系統、鏡掃描系統和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機和圖像輸出設備
二. 原理
Confocal 利用放置在光源後的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發射的螢光成像在探測針孔上，該點以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描，從而產生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續的光切圖像 。
三. 雷射掃描共焦顯微鏡的設計特點:
1.點照明
2.具有照明pinhole和探測pinhole
3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面
4.具有掃描系統—— 逐點掃描成像
5.具有多個（四個） 螢光通道，可同時探測多個被標記物
l Leica TCS NT 的技術指標
1. xy解析度比傳統顯微鏡小1.4x
傳統顯微鏡: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡)
取決於三點: 物鏡的景深, 與NA成反比
Z軸的最大移動範圍
雷射的穿透力
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm
取決於兩點: 物鏡的數值孔徑NA
Z軸的最小移動步距: 40nm
Z軸的解析度: 0.35 mm
4. 雷射器
Kr/Ar雷射器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar雷射器(UV): 361nm
• 雷射器的特點:
1) 方向性好: 雷射基本眼直線傳播
2) 單色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 雷射方向性好, 其在空間上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 雷射為平面偏振光, 光纖耦合
5. 四個螢光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時採集
多標記螢光圖像外還可以同時採集透射光圖像,但透
射光圖像為非共焦圖像
4. 雷射器
Kr/Ar雷射器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar雷射器(UV): 361nm
• 雷射器的特點:
1) 方向性好: 雷射基本眼直線傳播
2) 單色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 雷射方向性好, 其在空間上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 雷射為平面偏振光, 光纖耦合
5. 四個螢光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時採集
多標記螢光圖像外還可以同時採集透射光圖像,但透
射光圖像為非共焦圖像
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