植物細胞微絲束的光學顯微鏡觀察

【基本原理】

細胞骨架在通常情況下不穩定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當用適當濃度的TritonX-100 處理細胞時，能溶解質膜結構中及細胞內許多蛋白質，而細胞骨架系統的蛋白質卻不被破壞顯得更清晰，M-緩衝液洗滌細胞，可以提高細胞骨架的穩定性，戊二醛固定能較好地保存細胞骨架成分，經考馬斯亮藍R250 染色後，可使細胞骨架蛋白著色，而胞質背景著色弱，有利細胞骨架纖維顯示。

微絲、微管和中間纖維都是直徑很小的結構，最大的單根微管才25nm 左右，只能在電鏡下才能觀察到。目前研究細胞骨架的主要方法是應用高壓電鏡或免疫螢光顯微鏡技術。本實驗用普通光鏡觀察到細胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結構經染色後，有誇大作用。由於細胞經TritonX-100抽提後剩下的主要是細胞骨架成分，使得顯現更清晰。細胞骨架是指細胞質中縱橫交錯的纖維網絡結構，按組成成分和形態結構的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質運輸等起重要作用。光學顯微鏡下細胞骨架的形態學觀察多用1% Triton X-100 處理細胞，可使細胞膜溶解，而細胞骨架系統的蛋白質被保存， 再用考馬斯亮蘭R250 染色，使得胞質中細胞骨架得以清晰顯現。

【實驗用品】

1．材料：新鮮洋蔥鱗莖

2．試劑 1） M 緩衝液（pH 7.2）各成分終濃度為：

50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)；

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；

0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)

2） 6mmol/L PBS 磷酸緩衝液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:3

3） 0.7% NaCl 生理鹽水

4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶於 M-緩衝液

5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL

6） 0.2% 考馬斯亮藍R250 染液 200mL：考馬斯亮藍R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸餾水46.5mL

3．儀器：光學顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片

【方法步驟】

【實驗結果】

洋蔥鱗莖外層與內層的表皮細胞比較（放大倍數10×20）

附：各種主要試劑的作用

1．Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非離子去垢劑；適當濃度的Triton X-100，可使細胞膜溶解，而細胞質中的細胞骨架系統可被保存。

2．M－緩衝液和磷酸緩衝液作用：維持細胞的滲透壓。

3．EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金屬離子；後者專一性螯合Ca2＋，主要是高濃度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA 來降低Ca2＋的濃度。

4．戊二醛作用：良好的固定劑，使細胞結構保持它原有狀態；

5．考馬斯亮蘭作用：非專一性結合蛋白質，使蛋白著色（藍色）。