2020諾貝爾化學獎花落CRISPR基因編輯，生物學大放異彩

圖片來源：www.businessinsider.com

2020年10月7日，諾貝爾化學獎揭曉。Emmanuelle Charpentier（埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶）和Jennifer A. Doudna（詹妮弗·杜德納）獲此殊榮，以表彰她們在「憑藉開發基因組編輯方法」方面作出的貢獻，兩位獲獎者將分享1000萬瑞典克朗獎金（折合人民幣約763萬）。華裔科學家張鋒憾失此獎，其原因可能他不被認為是CRISPR 的奠基者，而諾貝爾獎更傾向於頒給新技術領域的開創者。

上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所王穎認為，「能在這麼短的時間裡拿到諾貝爾獎，說明學界充分肯定這項技術，它從原創到應用已呈現出爆發性增長，未來將會給人類健康帶來巨大變化。」王穎介紹，「基因剪刀」技術在很多領域都有商業應用價值，這一成果誕生之初就擁有專利，獲得了巨額融資，堪稱產學研結合的典範。

一、CRISPR的發展簡史

關於這個技術，老編我也確實很震驚，想當年（2014年下半年），公司的大老闆就跟我提及這個技術，不曾想到，這才6年多竟然直接就獲得諾貝爾獎了...讓我們來翻看一下關於CRISPR的發展史：

1987年，Nakata研究組偶然地發現大腸桿菌在位於iap的3』端存在含有29個鹼基的高度同源序列重複性出現，且這些重複序列被含32個鹼基的序列間隔開。

1989年-1999年，陸續有相關研究指出類似的重複序列存在於多種細菌及古生菌中。2000年，Mojica等人通過比對發現這種重複元件存在於20多種細菌及古生菌中，並將這種核酸序列命名為短規律性間隔重複序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，因其高度保守性，猜測其一定具有重要的生物學功能。

2002年，CRISPR一詞正式登上歷史舞臺。Jansen實驗室通過生物信息學分析發現，這種新型DNA序列家族只存在於細菌及古生菌中，而在真核生物及病毒中沒有被發現，並將這種序列稱為規律間隔成簇短回文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)。他們將臨近CRISPR locus的基因命名為cas（CRISPR-associated），並發現了4個cas基因（cas1, cas2, cas3, cas4）。

2005年，Mojica，Bolotin和Pourcel三個研究組指出CRISPR中的間隔序列來自於外來噬菌體或質粒，其中Mojica實驗室驚喜地發現病毒無法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細胞，而易侵入那些沒有間隔序列的細胞，由此他們提出CRISPR可能參與細菌的免疫功能的假說。

2007年，CRISPR能在細菌的免疫功能中起作用首次得到實驗證實。Horvath研究組發現嗜熱鏈球菌被病毒入侵後整合了來自噬菌體基因組新的間隔區序列，同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。同時人為地去除或添加特定的間隔區序列，會影響細菌的抗性表型。因此，他們認為CRISPR及cas基因一起為嗜熱鏈球菌提供了對噬菌體的抗性作用，同時抗性的特異性取決於CRISPR中的間隔區序列，細菌的這種免疫性是可以遺傳的。至此，雖然科學家並不清楚CRISPR/Cas抵抗病毒的具體機制，但他們開始逐漸揭開其神秘的面紗。

2008年，Oost實驗室揭示了宿主細胞中CRISPR的間隔序列如何在cas蛋白的協助下介導發揮抗病毒作用。他們發現在CRISPR轉錄後，cas蛋白會形成一個稱為Cascade的複合物，裂解每個重複單元中的CRISPR RNA前體（pre-crRNA），但裂解產物都保留了間隔序列。在解旋酶cas3的作用下，成熟的CRISPR RNA(crRNA)發揮小嚮導RNA（small guide RNA）的角色，促使Cascade幹預病毒的增殖。

2009年，Mojica團隊指出前間隔序列臨近的PAM序列為原核生物中CRISPR/Cas發揮免疫識別提供了靶標。

2011年，Charpentier研究組通過對人類病原體化膿性鏈球菌的差異化RNA測序，揭示了反式編碼crRNA（tracrRNA）參與pre-crRNA的加工成熟過程。他們指出，tracrRNA通過24個核苷酸與pre-crRNA中的重複序列互補配對，在保守的內源性RNA酶III和CRISPR相關的Csn1蛋白的參與下指導pre-crRNA的成熟過程，這些組分對保護化膿性鏈球菌免受噬菌體DNA的入侵必不可少，研究揭示了crRNA成熟的新途徑。

以上我們一直在介紹CRISPR/Cas的發現及細菌、古細菌如何利用該系統來沉默外來核酸以抵禦病毒及質粒的入侵。

CRISPR/Cas作為基因編輯系統被應用最早開始於2012年兩位女神（即此次的諾貝爾化學獎得主）的強強聯合。她們通過體外實驗證明：成熟的crRNA通過鹼基互補配對與tracrRNA形成特殊的雙鏈RNA結構，指導cas9蛋白在目標DNA上引起雙鏈斷裂。在與crRNA指導序列互補的位點，cas9蛋白的HNH核酸酶結構域切割crRNA的互補鏈，而cas9蛋白RuvC樣結構域切割非互補鏈。當雙tracrRNA：crRNA被嵌合到一條RNA時，同樣可以指導cas9切割雙鏈DNA。她們的研究證明，在雙鏈RNA指導下切割雙鏈DNA斷裂的內切酶家族並揭示了CRISPR/Cas系統在RNA指導下進行基因編輯的巨大潛力。

CRISPR/Cas系統發現歷程中的主要貢獻者△

之後就一發不可收拾...

2013年初，兩篇Science和一篇Cell文章，它們分別由來自於哈佛大學醫學院的George Church、麻省理工學院博德研究所的張鋒以及加州大學舊金山分校系統及合成生物學中心的Lei S. Qi（目前就職於史丹福大學）實驗室，這三篇文章都將CRISPR/Cas系統成功應用到哺乳動物細胞中。其中Church研究組設計了II型CRISPR/Cas系統，在人類細胞中設計特定的gRNA。對於內源性AAVS1基因座，他們成功獲得了293T細胞中10％至25％，K562細胞中13％至8％以及誘導多能幹細胞中2％至4％的靶向率。他們同時表明這個過程依賴於CRISPR組件，是特定的序列；在同時引入多個gRNA時，可以實現對目標基因座的多重編輯。張鋒實驗室證實了cas9可以在小RNA的指導下在人類及小鼠細胞中對內源基因座實現精確切割，同時他們將cas9改造為缺口酶促進同源修復。Qi與同事則將II型CRISPR/Cas系統中的cas9蛋白改造成失去核酸內切酶活性的dCas9，將其與gRNA共表達，產生一種DNA識別複合物使其特異性地幹擾轉錄延伸，RNA聚合酶或轉錄因子與DNA的結合達到抑制目標基因表達的目的。他們將其稱為CRISPRi，實現了對大腸桿菌中基因的有效抑制，且沒有明顯的脫靶效應。而且可以實現同時抑制多個基因，他們表明CRISPRi也適用於哺乳動物細胞。很快人們利用CRISPR/Cas系統實現了對斑馬魚、真菌及細菌的基因編輯。

2013年5月，Jaenisch研究組利用CRISPR/Cas介導的基因工程技術製造了在多個基因上含有多重突變的小鼠，極大地促進了體內多基因的功能學研究。隨後，人們實現了對果蠅、線蟲、大鼠、豬、羊、以及水稻、小麥、高粱等多種生物的基因編輯。

2013年12月，李勁松研究組和Hans Clevers研究組利用CRISPR/Cas9系統分別校正了小鼠白內障及人幹細胞中一種與囊腫性纖維化相關聯的基因缺陷。同時，研究者通過向人類細胞轉染慢病毒包裝的sgRNA庫，實現了對基因組範圍的功能性篩選。

2015年4月，黃軍就和團隊首次修飾人類胚胎DNA，為治療一種在中國南方兒童中常見的遺傳病——地中海貧血症提供了可能。

隨著對CRISPR系統研究的不斷深入，也暴露了一定的缺陷和局限性，如嚴重的脫靶效應。

2015年9月，張鋒研究組報導了一種不同於Cas9的新型2類CRISPR效應因子Cpf1。他們的研究證明，Cpf1是一種不依賴tracrRNA，由單個RNA介導的核酸內切酶。Cas9是在同一個位置同時剪切DNA分子的雙鏈，形成的是平末端；而Cpf1剪切後形成是兩個不同長度的鏈，被稱之為黏性末端。同時Cpf1能夠識別富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，可以擴展CRISPR的編輯範圍。

......

更多歷史請看：基因編輯技術CRISPR的發展簡史：從發現到爆炸(https://www.sohu.com/a/218322803_733985)

所以，滿打滿算，其實也就才8年多時間...看來，想要在生物學領域有所建樹的小夥伴們，未來可期啊！

二、CRISPR技術的另一面

技術無罪，但使用者分三六九等。曾轟動一時的基因編輯嬰兒事件，想必很多人都有所了解。賀建奎，原南方科技大學副教授，主要研究實驗室用物理，統計和信息學的交叉技術來研究複雜的生物系統。研究集中於免疫組庫測序，個體化醫療，生物信息學和系統生物學。2018年11月26日，賀建奎「基因編輯嬰兒」事件引發軒然大波。業內專家對實驗的動機和必要性、實驗過程的合規性、實驗影響的不可控性提出質疑。他也因此入選《自然》2018十大人物，但卻不是正面人物，而是被稱為CRISPR流氓。2019年12月30日，「基因編輯嬰兒」案在深圳市南山區人民法院一審公開宣判，賀建奎被依法判處有期徒刑三年，並處罰金人民幣三百萬元。

人民日報曾評論：「相關事件仍然迷霧重重，但公眾焦慮揮之不去：潘多拉魔盒一旦打開，誰來收場？技術無罪，但失控的技術可能帶來災難。弘揚學術道德和科研倫理，這是科技工作者的安身之本。無治理則無倫理，讓科技趨利避害，除了寄希望於科學家的道德自覺，更須立法跟進。」

三、過去5年諾貝爾化學獎得主名單

2019年——美國和日本3位科學家 John B Goodenough、M. Stanley Whittlingham、Akira Yoshino獲獎，獲獎理由是「在鋰離子電池的發展方面作出的貢獻」。

2018年——美國科學家Frances H. Arnoid獲獎，獲獎理由是「研究酶的定向進化」；另外兩位獲獎者是美國的George P. Smith和英國的Sir Gregory P. Winter，獲獎理由是「研究縮氨酸和抗體的噬菌體展示技術」。

2017年——瑞士、美國和英國3位科學家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson獲獎，獲獎理由是「研發出冷凍電鏡，用於溶液中生物分子結構的高解析度測定」。

2016年——法國、美國、荷蘭3位科學家Jean-Pierre Sauvage、J. Fraser Stoddart和Bernard L. Feringa獲獎，獲獎理由是「分子機器的設計與合成」。

2015年——瑞典、美國、土耳其3位科學家Tomas Lindahl、Paul Modrich和Aziz Sancar獲獎，獲獎理由是「DNA修復的機制研究」。

四、諾貝爾化學獎小知識

——截至2019年，諾貝爾化學獎共頒發了111次，沒有頒發的8年分別是1916、1917、1919、1924、1933、1940、1941和1942年。

——1901年至2019年，共184人次獲獎，實際獲獎個人為183人，因為英國科學家Frederick Sanger於1958年和1980年兩次獲獎。

——111次頒獎中，63次為單獨獲獎者，23次為2人共享，25次為3人共享。

——最年輕的獲獎者是法國科學家Frédéric Joliot，1915年因「合成新的放射性元素」與妻子Irène Joliot-Curie一起獲獎，時年35歲。

——最年長的獲獎者是美國科學家John B. Goodenough，2019年因「在鋰離子電池的發展方面作出的貢獻」獲獎，時年97歲。他也是諾獎得主中獲獎時最年長的一位。

——在此次諾貝爾化學獎之前，只有5位女性獲得過諾貝爾化學獎。分別是1911年的居裡夫人（居裡夫人另外還獲得1903年的物理學獎）、1935年的Irène Joliot-Curie（居裡夫人的女兒）、1964年的Dorothy Crowfoot Hodgkin、2009年的Ada Yonath，以及2018年的Frances H. Arnold。

唯問老編根據知識分子等公眾號資料綜合整理