蘋果病毒病是危害蘋果樹體生長的最主要的病害之一。給果農造成了嚴重的經濟損失。據報導,世界上幾乎所有栽培蘋果的國家和地區都有病毒的危害。截止目前為止。世界各地已報告的蘋果病毒已達有39種之多。根據病毒對蘋果的危害特點。
通常把蘋果病毒分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒兩大類:① 潛隱性病毒。這類病毒一般在蘋果的栽培品種上不表現明顯的症狀。我國分布最廣的是蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋果莖溝病毒 fASGV)年II蘋果莖痘病毒(ASPVl。我國各蘋果產區主要栽培品種的潛隱性病毒的帶毒株率在60%~80%。②非潛隱性病毒。這類病毒侵染蘋果樹後,在大多數品種上都表現明顯的症狀,根據其症狀特點就可進行識別。我國主要有蘋果花葉病毒、蘋果綠皺果病毒和蘋果鏽果類病毒。
1、蘋果病毒病的種類
1.1 蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)
為纖毛病毒科(nexiviridae)髮狀病毒屬 (Trieho virus)代表種。可侵染多種仁果類和核果類果樹,廣泛分布於世界各個果產區。該病毒侵染蘋果樹一般不產生明顯症狀。但可與其他病毒複合侵染引起樹體衰退。梨樹感染該病毒後。在某些敏感的植株上產生褪綠斑或環紋花葉症狀。該病毒還可引起核果類果樹果實環斑或葉片褪綠斑及裂皮等病害症狀。該病毒侵染蘋果樹後,一般不表明症狀僅可影響產量。
1.2蘋果莖溝病毒(ASGV)
是分布最為廣泛的蘋果病毒,可侵染多種禾本科植物,在果樹上主要通過嫁接和機械途徑傳播,關於該病毒的自然傳播途徑尚不清楚。該病毒侵染蘋果後一般不表現明顯的症狀,但是可引起樹勢生長緩慢,產量降低,品質下降。2年生梨樹感染該病毒後,幹徑生長速度降低 63.0%,莖高降低58.0%,枝梢長降低51.0%;梨幼苗幹莖降低11.7%,苗高降低13.5%。其生長緩慢主要原因與生長期幾種促進生長的內源激素(IAA、GA3、CTK)大幅下降有關。
1.3蘋果莖痘病毒(ASPV)
可侵染多種果樹,分布非常廣泛。ASPV為潛隱性蘋果病毒,在大多數的蘋果品種上一般不表現症狀,在一些敏感的砧木(virginia Crab) 和栽培品種(Charden和Reinette Clochard)上症狀較明顯,主要表現為葉片反卷、木質部莖痘斑、果實凹陷、葉偏上性生長。在梨樹上,ASPV 能引起梨石痘病(Pear stony pitl、梨脈黃病Pear vein velloWl等多種病症。
1.4蘋果花葉病毒(APMV)
除蘋果和梨外,APMV還有30多種寄主植物,主要為木本植物。APMV侵染蘋果後病樹葉片出現鮮黃色或黃白色斑,或深綠淺綠相間。按變色斑分布樣式,大體有斑駁型、網紋型、花葉型、環斑型、鑲邊型等幾種類型,各種類型的症狀可能在同一枝或同一葉片混合出現。可使感病品種的樹體生長減少50%,樹幹直徑減少20%,蘋果產量減少30%。主要通過嫁接和育苗圃根系嫁接傳播。
1.5蘋果鏽果類病毒(ASSVd)
可侵染多種核果類和仁果類果樹。其發病症狀可由於品種和變種不同而不同。ASSVd在一些新品種上的症狀主要是果面凹陷不平,而在一些老品種上主要花臉。目前在genebank中登記的蘋果ASSVd的變種序列達48條,煙臺市農業科學研究院研究表明,在蘋果上多為複合侵染,由多條ASSVd變種序列的複合物所侵染。
1.6蘋果凹果類病毒(ADFVd)
該類病毒分布範圍比較廣,可侵染多種果樹。該病毒1996年首次在義大利發現,據報導該病毒侵染的蘋果品種主要有紅星、嘎拉、粉紅女士、布瑞本和富士等。其主要發病症狀果實畸形帶有綠色的類似凹坑的斑點。
2、蘋果病毒病檢測
蘋果病毒病的檢測目前所採用的技術包括指示植物法、血清學檢測技術、分子生物學技術和電鏡技術。
2.1指示植物法
該方法主要是通過不同的病毒在不同或相同的寄主植物上產生不同的症狀來進行的。以對某種病毒十分敏感的植物作為指示物,將脫毒處理後獲得的植株,嫁接在指示植物上,根據病毒侵染指示植物後的症狀,對病毒的存在與否及種類做出鑑別。常用的病毒指示植物主要有黎科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。該方法缺點是特異性較差,靈敏度也較低,往往存在一病多症、多病一症的現象。檢測速度慢,受季節限制,獲得檢測結果所需時間長,該方法一般需要1-2年。
2.2血清學檢測法
目前最常用的血清學方法是酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)。ELISA是將抗原和抗體的免疫反應與酶的高效催化反應相結合而應用於植物病毒檢測的方法。其原理是通過化學的方法,將酶與抗體或抗原結合起來,形成酶標記物,具有活性的酶標記物與相應的抗原或抗體反應,形成更大的複合體,加入酶反應底物呈顏色反應,從而達到檢測病毒的目的。ELISA法檢測病毒具有成本低,適於測定大量樣品,靈敏度較高,可檢測ng(10胡g)水平的病毒,操作簡單,不需要使用同位素和複雜的設備,且對人體基本無害等一系列優點。
但是,此法檢測需製備高質量的抗血清,免疫反應物消耗量較大,抗體(或抗原)被酶聯板吸附後與抗原(或抗體1的結合力下降,抗原與抗體結合比在液相中慢。而且有的病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白,如類病毒則沒有外殼蛋白:受病毒系統和複合侵染的木本植物,鈍化病毒和製備抗血清難於完成:寄主植物中低濃度的病毒無法檢測。檢測時有假陽性反應,需要設置各種對照。
2.3分子生物學檢測
分子生物學方法是通過檢測病毒核酸來證實病毒的存在。該技術比ELISA靈敏度高、特異性強、快速,可用於大量樣品的檢測。並且適應範圍廣,其應用的對象為RNA病毒、DNA病毒及類病毒。目前常用的分子生物學技術包括核酸分子雜交技術、雙鏈RNA電泳技術、RT— PCR技術。
2.3.1分子雜交技術利用互補的核苷酸序列通過鹼基配對形成穩定的雜合雙鏈分子的過程來進行的,檢測對象是基因組DNA或總RNA。該方法特異性強,靈敏度高,可檢測到1pg的植物病毒基因組DNA,但存在同位素標記有放射性汙染,cDNA探針半衰期短的缺點。
2.3.2 雙鏈RNA電泳技術其原理是 ssRNA病毒在植物體內增殖,通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的鹼基配對dsRNA。 dsRNA經提純、電泳、染色後,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,並且有些單個病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特徵。因此。利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類。已知和未知的病毒及低濃度的病毒,具有快速、靈敏、簡便等優點。但鈍化dsRNA比較麻煩,不能檢測小於ng級水平及大規模樣品。
2.3.3 RT—PCR,技術是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法,是目前應用最為廣泛的果樹病毒檢測技術。該技術克服了上述兩種技術的缺點,可檢測fg(10小g)濃度的植物病毒及大規模的樣品。近年來發展了複合RT—PCR 是在同一RT—PCR反應體系中用幾對不同的引物同時檢測多個目的片段。應用複合RT— PCR和用單一RT—PCR做相同數目的病毒檢測相比,節約了時間和試劑。
PCR技術用於植物病毒的檢測具有特異性強、靈敏度高、快速簡便又無放射性的危害。近來,又衍生出一些以PCR 技術為基礎的病毒檢測方法,如RT—PCR法、 IC—PCR法、IC—RT—PCR法、PCR微量板雜交法,套式PCR等。在RT—PCR基礎上又發展了 IC—RT—PCR和多重IC—RT—PCR。與RT— PCR相比,IC—RT—PCR技術可使靈敏度提高 1 250倍,多重IC—RT—PCR可以準確的同時檢測出兩種以上症狀相似、難以區分的病毒。
2.4電鏡技術
電子顯微鏡以電磁波為光源,利用短波電子流,解析度可達到0,1 nm,而病毒粒體大小為10~100 nm,採用電鏡觀察有無病毒存在。利用該方法應該首先對不同病毒組的形態和典型病毒的特點有所了解,將病毒粒體經過提純,用超速離心機反覆低溫離心,將病毒粒子提純分離出來。而後用提純液進行電鏡製片,觀察病毒形態結構。由於電子穿透能力低,樣品必須很薄,制樣需選取病毒濃度最高的組織。