眾望所歸的CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了今年的諾貝爾化學獎。10月7日，瑞典皇家科學院授予法國科學家埃曼紐爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和美國科學家詹妮弗·杜德納（Jennifer A.Doudna）諾貝爾化學獎，以表彰她們在基因編輯技術方面的貢獻。這一技術被稱為「基因剪刀」技術。研究人員利用這項技術可以極其精確地改變動物、植物和微生物的DNA。「它不僅徹底改變了基礎科學，可以創造新型作物，還開創了新的醫療方法。」諾貝爾化學獎委員會主席克拉斯·古斯塔夫松表示。#基因剪刀#
和以往的基因編輯技術相比，「基因剪刀」技術簡單、易學、價廉，大大降低了重寫生命密碼的門檻，能廣泛應用到農業、醫療、工業、環境等領域。2012年8月，卡彭蒂耶和杜德納成功解析CRISPR/Cas9基因編輯的工作原理後，其應用就得到快速推進。2013年2月，美籍華裔科學家張鋒首次將CRISPR/Cas9基因編輯技術應用於哺乳動物和人類細胞。雙方一度合作成立公司，共同推進CRISPR/Cas9基因編輯技術在疾病治療方面的研發。值得一提的是，張鋒此次雖未能摘得諾貝爾獎，但在CRISPR/Cas9技術研發與應用方面同樣居功至偉。
後來，卡彭蒂耶、杜德納與張鋒因專利權屬發生爭議，不過，各方通過布局專利推廣CRISPR/Cas9應用的步伐從未停止。目前，全球關於CRISPR/Cas9的應用呈爆炸式增長，我國在CRISPR/Cas9應用方面走在了前列。植物研究人員利用該技術開發了抗黴菌、害蟲和乾旱的作物，新的癌症療法正在進行臨床試驗，治癒遺傳性疾病的夢想或許在不遠的將來就能實現。
「基因剪刀」有何魔力？目前這項技術的專利布局情況怎樣？應用重點有哪些領域？對此，本報記者採訪了代理過多件CRISPR/Cas9相關專利申請的北京康信智慧財產權代理有限責任公司專利代理師沈敬亭、陳知宇、曲在丹。
問：什麼是CRISPR基因編輯技術?為什麼會被稱為「基因剪刀」技術？
答：CRISPR是英文clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats的縮寫，即規律成簇間隔短回文重複。它是從細菌和古菌進化出來抵禦病毒和質粒入侵的RNA指導的適應性免疫系統，其中含有曾經攻擊過該細菌的病毒的基因片段。它利用RNA來引導核酸酶與特定核酸序列相結合併且將它們切斷。當病毒入侵細菌時，細菌能夠捕捉到外來遺傳物質的片段並且將它們整合到自身基因組中的CRISPR序列中。CRISPR序列轉錄生成的CRISPR RNA（crRNA）能夠與Cas核酸酶相結合，通過與靶點核酸序列進行鹼基配對為Cas核酸酶提供結合特異性。Cas核酸酶和crRNA結合之後，能夠在細菌體內起到監控病毒入侵的作用，當與crRNA匹配的遺傳片段再度出現時，Cas核酸酶能夠切斷這些遺傳片段，從而提供免疫保護作用。
借用一篇科普文獻的思路，我們可以將細菌的防禦系統想像成一個資料庫（CRISPR序列）+一個剪刀工廠（Cas），細菌處理外來遺傳物質的片段並且將它們整合到自身基因組中的CRISPR序列中，而其中的重複片段則充當分隔這些病毒信息的擋板。剪刀工廠生產不同的Cas蛋白。
每當有新病毒進攻，剪刀就會跑出來剪斷它的DNA，然後把其中一小段帶回資料庫裡儲存起來，這段DNA會轉錄成CRISPR RNA（crRNA），和另一把剪刀結合。如果同樣的病毒再次進攻，它們就可以迅速匹配到敵人，然後Cas會特異性地切斷對方的DNA，從而保護細菌免受病毒侵襲。
問：CRISPR技術從被發明到獲得諾貝爾獎僅僅用了8年，它到底具有哪些重大價值？
答：在回答這個問題之前，我們必須了解一下基因編輯領域的現狀。在CRISPR廣泛應用之前，基因編輯主要依賴於基因突變技術、轉基因技術、RNA幹擾（RNAi）技術、核外遺傳技術、同源重組技術等幾個技術進行，這些技術在精準性、高效性和適應性等方面都存在一定問題。比如基因突變技術最大的問題在於突變的隨機性，無法控制突變位點，因此有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質難以控制。RNAi技術是相對高效並且相對特異的，但仍存在對靶基因的抑制不徹底等問題。
反觀CRISPR基因編輯技術，其精髓在於精準基因組編輯。此外，由於PAM序列結構簡單（5』-NGG-3』），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛應用。Cas9和Cas12a能夠在多種細胞種類和生物中起作用，其中，CRISPR/Cas9系統已經成功應用於植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統。
可以說，CRISPR/Cas技術提供了一種修改、調控和觀察基因組的便捷且具備很強適應性的工具。這讓它可以在許多領域的生物研究中得到應用。CRISPR/Cas工具極大地加快了科學研究的腳步，而基於Cas生物技術的研發同樣進展迅速。多項基於Cas9的臨床試驗正在或即將進行。這些臨床試驗的結果將指引未來體細胞基因編輯在體外和患者中應用。CRISPR/Cas9在農業方面的應用已經產生了可以進入市場的產品。CRISPR/Cas工具箱日漸擴展的應用確立了這一系統在基因組編輯，甚至是基因工程領域的前沿位置。
問：雖然今年的諾貝爾化學獎頒給了埃曼紐爾·卡彭蒂耶和詹妮弗·杜德納，但張鋒也被認為在CRISPR/Cas9領域做出了重要貢獻。從專利布局上看，兩者有何差別，各自的技術貢獻體現在哪些方面？
答：卡彭蒂耶、杜德納和張鋒三人是當之無愧的CRISPR三巨頭：2012年8月17日，卡彭蒂耶、杜德納合作，在科學雜誌發表了基因編輯史上的裡程碑論文，成功解析了CRISPR/Cas9基因編輯的工作原理。幾個月後的2013年2月15日，張鋒在科學雜誌也發表了論文，首次將CRISPR/Cas9基因編輯技術應用於哺乳動物和人類細胞。此後，卡彭蒂耶和杜德納獲得了2015年的科學突破獎、2016年的阿爾珀特獎、2020年的沃爾夫獎和2020年的諾貝爾獎。而卡彭蒂耶、杜德納和張鋒三人則共同獲得了2016年唐獎（Tang Prize）和2016年蓋爾德納國際獎。一開始，三人合夥創建基因編輯公司——Editas Medicine，但因談判破裂，杜德納單飛創立了Intellia Therapeutics公司。CRISPR/Cas9的專利之爭就此開始。
卡彭蒂耶和杜德納團隊的專利申請日（2013年3月15日）早於張鋒團隊的專利申請日（2013年7月21日，要求了2012年12月12日的最早優先權），按理說，其佔有的優勢非常大。但是由於張鋒團隊啟用了專利審查的快速通道，加速了審查流程。張鋒團隊被首先授予了一些重要專利，主要涉及將CRISPR系統用於真核細胞（包括人類細胞）。由於CRISPR基因編輯在疾病治療和基因改造方面極具應用價值，在真核細胞中的專利顯然是含金量最高的。
卡彭蒂耶和杜德納的專利主要涉及CRISPR的系統，包括CRISPR系統中所必須的各組分的設計，如DNA-靶RNA、用於位點特異性修飾的靶DNA、位點特異性修飾的多肽、靶DNA的位點特異性修飾的方法、靶核酸、試劑盒和組合物、遺傳修飾的細胞和由此轉基因的非人多細胞有機體等。
張鋒在中國的專利申請始於2013年（WO2014018423A2，發明名稱為「可誘導的DNA結合蛋白和其基因組的幹擾工具和應用」，申請日為2013年7月21日，最早優先權為2012年7月25日），他在中國的主要專利申請有40多件，主要涉及CRISPR系統的應用，例如基於CRISPR效應系統的診斷；用於基因組編輯以及用於特定靶向和治療的CRISPR/Cas系統和組合物的遞送、用途和治療應用；對CRISPR複合物的組分進行編碼的載體和載體系統以及用於設計和使用這種載體的方法；新型CRISPR酶以及系統等。
問：在CRISPR被證明具有基因編輯功能後，該項技術很快就被用於遺傳疾病的治療。國內關於CRISPR/Cas9技術的專利申請是否也呈現增長趨勢，主要申請人有哪些？
答：如圖表可見，除了2019年略有下降、2020年尚未結束以及疫情影響外，近年來隨著CRISPR/Cas9技術的廣泛應用，國內關於該技術的專利申請的確是呈現逐年增長的趨勢。
在中國的主要專利申請人包括中國農業大學、中國科學院遺傳與發育生物學研究所、華南農業大學、中國農業科學院作物科學研究所、浙江大學、中國科學院上海生命科學研究院、華中農業大學等科研院校。
問：目前，國內CRISPR/Cas9技術主要應用在哪些領域？
答：國內CRISPR/Cas9技術的主要應用領域涉及：
對CRISPR/Cas9系統本身進行改造，從而提高基因編輯的特異性、效率以及安全性。例如中國人民解放軍第二軍醫大學的專利申請CN104805099A提供了一種更安全的編碼Cas9蛋白的核酸分子。實驗發現目前廣泛應用的Cas9表達載體雖然能成功表達Cas9蛋白發揮作用，但載體所轉錄的mRNA序列本身可以作為microRNA let-7家族的吸附體而抑制let-7的功能，而let-7可以抑制多個癌基因的表達，因此目前應用的Cas9表達載體可以增加一些癌基因的表達從而增加癌症的風險。該專利申請提供的M-mir-Cas9表達載體所轉錄出的mRNA不能吸附let-7，同時依然能翻譯成完整的Cas9蛋白發揮作用，增加CRISPR/Cas9基因編輯工具的安全性。
動植物基因的定點修飾、敲除等，以構建動植物突變體庫，用於動植物的育種工作。例如青島市畜牧獸醫研究所的專利申請CN103805605A提供了一種通過Cas9系統在細胞或個體水平上對綿羊DKK2基因進行敲除或修飾，以解析綿羊DKK2基因的功能、構建綿羊DKK2基因突變庫，為綿羊育種服務。安徽省農業科學院水稻研究所的一系列相關專利申請構建了植物CRISPR/Cas9打靶重組載體，通過剪切造成水稻細胞DEP2基因、Ehd3基因、OsCHI基因等出現功能缺失突變，通過對功能缺失突變的株系進行表型鑑定，快速獲得閉穎授粉水稻、褐殼水稻以及生育期延長的水稻材料。
動植物基因的特異性敲除，用於治療疾病。例如上海金衛生物技術有限公司的一系列專利申請，使用CRISPR/Cas9特異性敲除人PD1或人CCR5基因，從而精確靶向人PD1基因或人CCR5基因並且實現基因敲除；武漢大學的專利CN104480144B涉及一種可用於愛滋病基因治療的CRISPR/Cas9重組慢病毒載體及其慢病毒，能夠在愛滋病毒輔助受體CXCR4的4個不同位點突變基因序列，且突變率高75%。經過重組慢病毒載體改造後的細胞不能被HIV感染。該方法較RNAi Knockdown、ZFN和TALEN等基因編輯技術具有更高的抑制愛滋病毒複製的效率，該系統構建快速、簡單、價廉且能阻止HIV病毒入侵，適合用於愛滋病基因治療。
病毒DNA的特異性敲除，用於治療疾病。例如南京大學的專利申請CN103911376A涉及CRISPR/Cas9特異性敲除B型肝炎病毒cccDNA。利用該發明製備的特異性靶向B型肝炎病毒cccDNA的sgRNA能夠精確靶向B型肝炎病毒cccDNA並且實現基因敲除。
構建動植物以及細胞模型的藥物篩選。例如上海雲舜生物技術有限公司的專利申請CN104293831A基於CRISPR/Cas9基因編輯技術建立高血壓小鼠模型，與現有技術相比，該發明技術方案是一種便捷、耗時短、效果好的方法；中國人民解放軍第二軍醫大學的專利申請CN104726494B利用CRISPR/Cas9技術誘導幹細胞中特異位點染色體易位發生，由此製備了細胞模型，以及進一步構建攜帶特異位點染色體易位的動物模型的方法。
這對於研究染色體易位，融合基因的功能，染色體相互作用的研究，以及藥物的篩選評價，都有較大應用前景；中國農業大學的專利申請CN105463027A利用CRISPR/Cas9修飾豬Trim63基因，獲得高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆豬，無需再對克隆豬進行手術等人工幹預手段，提高了構建疾病模型的效率。該發明還首次在大動物上利用成對Cas9n打靶載體對大動物進行基因編輯，為大動物利用CRISPR/Cas9技術進行基因功能研究及疾病模型建立奠定了基礎。（本報記者 劉仁）
（文章來源：中國智慧財產權報）
2020 年諾貝爾化學獎花落基因編輯技術！「基因剪刀」專利如何重寫生命密碼？
（責任編輯：呂可珂 編輯：曹雅暉 審校：崔靜思 蔡瑩 王乃兵）