【安捷倫】別怪我沒告訴你,肽譜分析真的「肽」重要了

中國藥典和歐盟藥典在蛋白質藥物成品檢驗中規定肽圖需要與標準品一致，因為屬於鑑別項目，不需要定量比較，所以很多人覺得可以「依葫蘆畫瓢」盡力就好。事實上，生物類似藥的肽譜是需要與原研藥完全一致的，另外很多實驗員在做肽譜分析時重現性很差，需要實驗操作者綜合考慮蛋白質本身、實驗目的以及預期結果，需要實驗員具備優質的樣品前處理技術、強大的技術分離能力和信息，才能夠獲取最佳的蛋白水解消化物分離，並進行肽段的可靠表徵分析。所以，別怪我沒告訴你，肽譜分析真的「肽」重要了，也是難度很高的一個檢測項目。乾貨太多，今天先從蛋白質酶解的獨立開發方案說起。

關於蛋白質酶解的獨立開發方案，

把濃縮過的「精華」給你

圖為蛋白質酶解的 5 大步驟

樣品前處理要「量體裁衣」

根據蛋白質的大小或結構，樣品的前處理方法不盡相同。 在特定的條件下，可能需要進行樣品富集，或從所添加的物質和穩定劑（用於產品劑型中）中分離蛋白質，尤其是在這些添加劑會干擾肽譜分析過程時。針對這些流程，現已開發出許多方法，每種蛋白質均具有一套對應的純化措施或處理方法。但是，酶解前通常會使用一些更常用的方法進行樣品純化，包括去除/富集、透析和凝膠過濾脫鹽。

去除和富集策略

去除和富集策略分別被開發用於去除樣品中的高豐度蛋白質或分離目標蛋白質。更多的時候，去除用於蛋白質組學應用，用以降低生物樣品（例如，血清）的複雜性，此類樣品中含有高濃度的白蛋白和免疫球蛋白。

去除策略可以利用免疫親和技術（例如，免疫沉澱、免疫共沉澱及免疫親和色譜法）。另一方面，富集技術會根據獨特的生化活性、翻譯後修飾  (PTM)  或胞內的空間定位分離細胞蛋白的亞類。翻譯後修飾（例如磷酸化和糖基化）可使用親和配體（例如，金屬離子親和色譜  (IMAC)  或固定化凝集素）分別進行富集。為引入獨特的蛋白質化學，其他技術需使用代謝或酶促結合修飾後的胺基酸或 PTM。

利用透析和脫鹽優化樣品處理

不論是簡單的樣品還是複雜的樣品，常需要通過透析或脫鹽對樣品進行優化處理，以確保它們酶解過程的兼容性。例如，由於質譜法 (MS) 將測定帶電離子，因此必須在 ms 前進行除鹽（特別是鈉鹽和磷酸鹽），最大程度減少它們對檢測的幹擾。

透析和脫鹽產物可進行緩衝液交換、脫鹽或小分子去除處理，以防止對後續過程的幹擾。透析是降低樣品鹽濃度的常規流程。具體步驟是先將樣品裝入透析袋（袋膜具有特定的孔隙）中，袋口打結，然後將其置入水浴或緩衝液中，通過擴散使鹽濃度達到平衡。大分子無法擴散出透析袋，會留在袋內。如果使用水浴，袋內小分子的濃度會緩慢降低直到透析袋內外濃度相同。達到平衡後，即可撕破透析袋，將其中的溶液倒入收集容器中。雖然透析體積可達幾升，但對於大量樣品卻並不實際，因為會需要幾天時間才能將鹽完全去除。

凝膠過濾  (GF)  是最實用的實驗室流程

凝膠過濾 (GF) 是最實用的實驗室流程，可在酶解前對樣品進行脫鹽。該方法是一種非吸附的色譜技術，可根據分子大小進行分子分離。脫鹽可被用於完全去除或降低樣品中的鹽濃度或其他小分子量成分，而緩衝液的更換則會使用一種新的緩衝液替換樣品中的緩衝液。

凝膠過濾法是最簡單的色譜操作法之一，因為樣品均在度洗脫條件下處理。在其分析形式中，凝膠過濾法（也稱為體積排阻色譜）可分離分子量差異大於兩倍的分子（例如，蛋白質）。在這些應用中，目標分離物質的體積差異非常大（即蛋白質與鹽相比）。

通過選擇凝膠過濾填料，可完全排除較大的分子，同時允許較小的分子自由擴散至 所有的孔隙中。色譜柱使用緩衝液進行平衡，它與樣品的緩衝液可能相同，也可能不同。將樣品加載至色譜柱後，再添加更多的色譜柱緩衝液（洗脫緩衝液），攜帶樣品分子自上而下地流過色譜柱。較大的分子（不能進入填料的孔隙中）首先從色譜柱中洗脫出來，然後是擴散入孔隙的較小分子，相對於較大的分子，小分子的洗脫時間更長。如果洗脫緩衝液與樣品使用的緩衝液不同，則較大的分子會從原始鹽中替換出來，並被這種新的緩衝液洗脫，從而從最初的樣品緩衝液中完全分離出來。

一張圖告訴你，化學裂解和酶解怎麼選？

裂解肽鍵的方法有兩種 ― 化學裂解和酶解，但是到底怎麼選，這取決於需要分析的蛋白質和您所期待的結果。一張圖告訴你，如何選擇酶解試劑。

為使蛋白水解酶有效地裂解肽鏈，需要利用各種試劑對樣品進行變性、還原和烷基化。而在酶解的部分還需要對酶解的 PH、酶解時間及溫度、還有裂解酶的濃度等因素充分考慮。

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