研究發現外泌體可介導CRISPR/Cas9系統靶向切割B型肝炎病毒基因組...

2021-01-08 生物谷

 

規律間隔成簇短回文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關（CRISPR associated，Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技術是基於細菌內的獲得性免疫機制改造而成的，其通過一條單鏈嚮導RNA（single guide RNA，gRNA）來識別特定的DNA序列，並引導具有核酸內切酶活性的Cas9蛋白剪切DNA雙鏈。與鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和轉錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）等基因編輯技術相比，改良後的CRISPR/Cas9系統僅由gRNA和Cas9蛋白兩部分組成，具有操作簡單、實驗周期短、成本低等優勢。

為了明確轉染了規律間隔成簇短回文重複序列及其相關蛋白9 （CRISPR/Cas9）表達質粒的細胞所分泌的外泌體中是否存在單鏈嚮導RNA（gRNA）和Cas9蛋白，並探索CRISPR/Cas9系統能否通過外泌體的細胞間傳遞，實現對周圍細胞靶基因的編輯，北京大學王傑， 陳然， 魯鳳民將CRISPR/Cas9表達質粒轉染至HuH7細胞中，收集細胞培養上清液，差速離心法濃縮和純化外泌體，通過電鏡和馬爾文雷射散射粒度測定儀分別測定外泌體的形態和粒徑，並利用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質印跡法分別檢測gRNA和Cas9蛋白水平。（2）將分別轉染1.2×B型肝炎病毒（HBV）表達質粒和HBV特異性CRISPR/Cas9表達質粒的HuH7細胞進行共培養。2 d後提取細胞內HBV DNA，經PCR擴增後測序。

結果發現，轉染CRISPR/Cas9表達質粒的HuH7細胞所產生的外泌體中不僅存在全長gRNA和Cas9蛋白，並可在細胞間傳遞其基因編輯功能，實現對周圍細胞HBV基因組的破壞。

作為一種潛在的遞送系統，外泌體可通過攜帶有功能的gRNA和Cas9蛋白在細胞間傳遞CRISPR/Cas9系統的基因編輯功能。這一現象也提示我們，在利用CRISPR/Cas9系統進行基因治療的過程中，也需要考慮攜帶有gRNA和Cas9蛋白的外泌體對周圍及遠端組織細胞的潛在影響。(生物谷Bioon.com）

 

 


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