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孫佳楠
上一期中我們介紹了Orbitrap Eclipse三合一質譜儀極其出色的硬體性能，以及在蛋白質組學領域的非凡表現。本期帶大家領略其如何將生物製品質譜表徵工作變得更簡單、看到生物製品最真實的原貌！
當前常規生物製品質譜表徵主要包含完整分子量的測定、肽圖解析、糖型鑑定等，通常利用不同的樣品前處理獲得複雜生物製品的完整分子量、胺基酸序列結果，然而在一定程度上卻失去了樣品的完整信息，引入其他副反應。大家知曉可以用Top-Down、Middle-Down的分析流程解決這一問題，但由於質譜儀性能的局限，未得到廣泛的應用。
賽默飛作為科研領域的領導者，致力於解決分析難題，全能型Orbitrap Eclipse將「簡單又複雜」的生物製品質譜表徵帶入了「Top/Middle-Down時代」。
來看Orbitrap Eclipse實力表現~
1、複雜生物製品的完整分子量測定
——糖基化位點較多的融合蛋白類
得益於PTCR（質子轉移電荷減少）技術、深度真空技術（氣壓可調0.5-20mTorr）。
單克隆抗體及ADC類蛋白樣品異質性相對較低，在傳統的LC-MS/MS（變性反相色譜或非變性分子排組色譜條件）中能夠獲得高信噪比、高質量精度的各成分及其含量分布。而含N-糖或O-糖位點較多的融合蛋白類，如細胞因子融合蛋白，異質性非常高，即使在非變性去唾液酸條件下仍舊無法有效區分每一成分，通常的解決方式是使用各種糖苷酶去除不同種類糖型，降低譜圖複雜性，然而卻失去了樣品的完整水平糖型信息。
Orbitrap Eclipse 針對不同的樣品分析可調節IRM中氣壓，提高信號響應，以及PTCR強力的加持技術則可簡單快速的解決此類困擾已久的難題，如圖1所示，在圖1A中選擇帶多質子且信號強度較高的m/z5677-5757範圍，經PTCR反應後降低質子數，從而降低各電荷態間的重疊度，此時可清晰的分辨每一成分，BioPharma Finder軟體去卷積後獲得該融合蛋白主要成分的分子量，為複雜生物製品的表徵提供完整信息。
2、非變性蛋白Top-Down分析
得益於ETD、EThcD、UVPD、HCD、深度真空技術、HMR、PTCR技術
（全能型Orbitrap Eclipse三合一質譜儀集各種利器於一身）
對於做蛋白藥物質譜表徵分析的人來說，理想的狀態是使用快速簡單甚至無需樣品前處理，直接進入LC-MS/MS或MS only對蛋白藥物進行表徵，高效且降低樣品前處理引入的幹擾，同時可直接對電荷變異體成分進行快速的確證。而現實是由於抗體分子大，碎片離子少且複雜導致在完整蛋白水平獲得較低的序列覆蓋度，實用價值低。Orbitrap Eclipse將非變性完整蛋白Top-Down分析推向嶄新的高度。
以Herceptin抗體為例，溶液置換成50mM乙酸銨（Herceptin濃度為2ug/uL），不經LC通過注射泵直接進入MS中，獲得高信噪比高質量精度的一級譜圖，隔離豐度最高的母離子（+27價）分別進行HCD、ETD、EThcD及UVPD的碎裂，且使用Orbitrap 240,000解析度進行高準確度二級碎片離子掃描，由於Orbitrap Eclipse具有HMR選項，可在二級譜圖中看到m/z達8000的豐富碎片離子。
圖3. 經BioPharma Finder解析後輕重鏈胺基酸序列覆蓋度
經BioPharma Finder解析後，輕鏈胺基酸序列覆蓋度為57%，重鏈胺基酸序列覆蓋度為36%（圖3），碎片離子質量偏差在3ppm以內，Orbitrap Eclipse在非變性條件下Top-Down結果刷新了以往的記錄。
值得注意的是，PTCR技術不僅在複雜生物製品分子量測定中大顯身手，而且能夠顯著降低ETD MS譜圖的複雜度（圖4），大大提高質量碎片離子的解析度（圖5），從而提升Middle-Down胺基酸序列的覆蓋度（圖6）。
圖4.NIST mAb Fd亞基經ETD碎裂以及PTCR反應後的二級碎片離子質譜圖
圖5.ETD only與ETD with PTCR二級/三級碎片離子鑑定分布圖
圖6.NIST標準抗體Middle-Down胺基酸序列覆蓋度
3、基於以上獨特的優勢性能，可進一步擴展其應用領域
如電荷變異體的快速鑑定；利用MHC(Major Histocompatibility Complex)-peptide複合物篩選高免疫原性疫苗時，採用Orbitrap Eclipse測定複合物的完整分子量和Top-Down，來評估多肽的交換（圖7）；此外多種碎裂方式與超高解析度Orbitrap的組合能夠更加準確的對未知蛋白進行從頭測序（De-novo sequencing）。
圖7.Orbitrap Eclipse評估MHC與多肽的交換，助力高免疫原性疫苗的篩選（Data Courtesy :Genentech）
結語：目前Orbitrap Eclipse是功能最為齊全的高分辨質譜儀之一，旨在解決蛋白質分析中極具挑戰的問題，持此利器定能推動生物學研究的進一步發展。
至此，ASMS新品連載正式完結啦！快和飛飛一起回顧下賽默飛2019新品質譜的精彩瞬間~
賽默飛於ASMS 2019上發布的兩款新品質譜再次刷新了Orbitrap的記錄——
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堪稱創新巔峰之作的全能型Orbitrap Eclipse三合一質譜儀，集各種高能軟硬體技術於一身，性能比尖，輕鬆應對蛋白質組學，生物製藥與蛋白質高級結構分析研究中的各項挑戰。