THE FACTS -3 F10SC消毒劑的最低抑菌濃度(MIC)及抑菌圈測定方法 ​

《The Facts》-3

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) And Zone Of Inhibition Determination Methods To Be Used When Testing F10SC Disinfectants

F10SC消毒劑的最低抑菌濃度(MIC)

及抑菌圈測定方法

- 摘要 -

F10超濃縮型消毒劑(F10SC)是一種以季銨鹽和雙胍類化合物為基礎的消毒劑。據獨立測試顯示，F10SC能夠有效消滅細菌、真菌、病毒和孢子(包括細菌和真菌孢子)。有報告指出，當採用抑菌圈法(紙片擴散法)測定細菌分離株的敏感性/耐藥性時，會出現不一致的結果。因此，為確定使用抑菌圈法評估F10SC的最合適的實驗室途徑，我們展開了以下研究，同時採用市售慶大黴素10µg藥敏紙片(每片含10微克慶大黴素)和恩諾沙星5µg藥敏紙片(每片含5微克恩諾沙星)進行對照試驗。

從1036個讀數中可以看出，8種試驗菌均在F10SC消毒劑的1:250倍肉湯稀釋液中表現出敏感性，在該濃度乃至更低濃度下，均可觀察到明顯的完全抑制。耐藥菌株，如銅綠假單胞菌和大腸桿菌，當F10SC藥敏紙片濃度相當於1:250倍肉湯稀釋液時，在瓊脂上產生了較小的抑菌圈，在F10SC的1:1000和1:4000倍肉湯稀釋液中被完全抑制。敏感菌株，如金黃色葡萄球菌，當F10SC藥敏紙片濃度相當於1:250倍肉湯稀釋液時，在瓊脂上產生了較大的抑菌圈，在F10SC的1:16000倍肉湯稀釋液中被完全抑制。慶大黴素與恩諾沙星對照組則各取了146個讀數。

不過，本研究也表明，在進行這種類型的測試時，必須嚴格控制好各項參數，否則可能出現不一致的結果，甚至產生誤導。

- 引言 -

本項研究的目的如下：

· 探索出一種能夠用於評估需氧菌和兼性厭氧菌對F10SC的敏感性的紙片瓊脂擴散法(抑菌圈法)。

· 比較試驗菌於4-6種不同的F10SC濃度下，在藥敏試驗常用的2種瓊脂上產生的抑菌圈大小，如MH瓊脂和Iso-Sensitest瓊脂。

· 比較8種試驗菌在2種瓊脂上對慶大黴素10µg藥敏紙片和恩諾沙星5µg藥敏紙片的敏感性/耐藥性。

· 測定F10SC對常見致病菌的最低抑菌濃度，包括已知的ATCC菌種、地方分離株及鳥類致病菌。

- 研究 -

試驗菌

以下為本次研究中使用的試驗菌：

菌懸液的製備

根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)指南，採用直接菌落懸浮法製備菌懸液。

將培養物接種於非選擇性瓊脂(營養瓊脂斜面)上，35℃(±2℃)孵育16-18h，再懸於0.85％無菌生理鹽水中。將製得的濃縮型懸浮液用0.85％生理鹽水校正至0.5個麥氏標準(600nm時透光率約為70-75％)，細菌近似濃度為1.5x10^8cfu/ml。BII Parrotshop

常量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)

肉湯稀釋法測定MIC根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)指南進行。

MH肉湯(pH值：7.2-7.4)的供應商為Merck。將肉湯按照廠商說明進行製備和滅菌。肉湯的陽離子濃度未調整，按原樣使用。

每種試驗菌各準備2套試管，每套11支。採用肉湯稀釋法，將F10SC與MH肉湯按1:125的比例稀釋(0.8%濃度)；1號管中僅加入1ml該溶液，2-11號管各加入無菌MH肉湯1ml——2號管中的F10SC比例被稀釋1倍，變為1/500(0.4%濃度)，如此連續倍比稀釋至第9管，使1-9號管中F10SC的比例分別為1/125至1/32000；10號管中僅含有接種過試驗菌的肉湯，作為陽性對照組；11號管中僅含有未接種試驗菌的肉湯，作為陰性對照組；10號管和11號管中均不含抗菌劑；所有試管中各含MH肉湯1ml。

以直接菌落懸浮法製備的菌懸液中，細菌近似濃度為1.5x10^8cfu/ml。取2ml該菌懸液以無菌生理鹽水稀釋成10ml，細菌近似濃度變為3x10^7cfu/ml(每管)。除陰性對照組外，含1ml肉湯的每支試管各接種10µl(0.01ml)稀釋後的菌懸液。此時每支試管中的細菌近似濃度為3x10^5cfu/ml。

採用平板計數瓊脂對懸液中的菌落總數進行測定，以確認其中存在的活菌數量。

所有試管35°C孵育16-20小時。以肉眼觀察，對試驗菌的生長產生明顯抑制的抗菌劑濃度最低管，其濃度即為該抗菌劑的最低抑菌濃度。

紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈

根據Koneman等人的描述，採用K-B紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈。

MH瓊脂(pH值7.2-7.4)的供應商為Merck。將瓊脂按照廠商說明進行製備和滅菌。在直徑90mm的培養皿中倒入±25ml瓊脂，厚度約為4mm。

Iso-Sensitest瓊脂的供應商為C. A. Milsch。將瓊脂按廠商說明進行製備和滅菌。同樣在直徑90mm培養皿中倒入±25ml瓊脂，厚度約為4mm。

藥敏紙片製作與F10SC原液

單張藥敏紙片的最大容量為10µl(0.01ml)，為使一張藥敏紙片上的活性物質水平與1ml特定的F10SC肉湯稀釋液保持一致，藥敏紙片需採用F10SC原液進行製作。

如：

藥敏紙片期望含藥量為：0.4%的F10SC (=F10SC的1:125倍稀釋液)

則：

即：藥敏紙片上0.01ml濃度為40%的F10SC原液與1ml濃度為0.4%的F10SC稀釋液中含有同樣多的活性成分。因此，採用濃度分別為40%-1.25%的原液製作藥敏紙片，可對應F10SC比例分別為1/250-1/8000的肉湯稀釋液。

此前的試驗中曾使用20µl更低濃度的原液製作藥敏紙片，結果很不理想。超過10µl的原液難以被紙片全部吸收，會導致抑菌圈出現變形。

培養皿的製備

無菌空白藥敏紙片的直徑為6.5mm，供應商為Davies Diagnostics。

本次試驗共使用MH瓊脂平板和Iso-Sensitet瓊脂平板各130個，每種濃度的F10SC均在2種瓊脂上分別進行了試驗(一式兩份)，在2種瓊脂平板上每個F10SC濃度下平均使用了6張藥敏紙片。

如前所述，將以直接菌落懸浮法製得的菌懸液接種至所有瓊脂平板上。

以無菌棉籤浸入調試好的菌懸液中蘸取適量液體，在處於室溫下的瓊脂平板上均勻劃線3次，橫穿整個表面。每次將平板旋轉約60°角，以確保試驗菌均勻分布。避免蘸取過多液體。

將平板靜置3-5分鐘，使瓊脂吸收表面多餘的水分。使用無菌鉗將空白的藥敏紙片貼於接種好的MH瓊脂平板和Iso-Sensitest瓊脂平板表面。每個90mm平板中大約貼3張紙片。用無菌鉗輕壓，確保紙片與瓊脂充分接觸。將作為對照組的慶大黴素10µg藥敏紙片和恩諾沙星5µg藥敏紙片也貼在接種好的2種瓊脂上。

使用微量移液管(Eppendorff)取不同濃度的F10SC原液各10µl分別滴於空白的藥敏紙片上。

紙片必須在接種後15分鐘內貼完。平板未倒置，35℃(±2℃)孵育16-18小時。所有試驗均為一式兩份，並對所有菌懸液進行了菌落總數測定。

藥敏試驗質量控制

本次研究採用以下三種ATCC標準菌株對MH瓊脂及肉湯進行質控：

MH瓊脂：採用以上全部三種菌株作為質控菌株。瓊脂深度控制在4mm左右，以儘量減小抑菌圈大小的變化。將慶大黴素10µg藥敏紙片貼於F10SC試驗用的MH瓊脂平板上。最後產生的抑菌圈的平均大小均在NCCLS規定的可接受範圍內。

MH肉湯：採用銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株。雖然南非標準局(SABS)無法提供NCCLS推薦用於檢測MH肉湯的金黃色葡萄球菌ATCC29213標準菌株，但使用銅綠假單胞菌ATCC27853和大腸桿菌ATCC25922進行質控已足以確保本次藥敏試驗結果的準確性與可靠性。使用MH肉湯將慶大黴素倍比稀釋成10µg/ml至0.078µg/ml一系列濃度。最後測得的最低抑菌濃度均處於MCCLS規定的可接受範圍內。

陽性對照組：以試驗中使用的菌懸液接種至無菌MH肉湯、MH瓊脂平板和Iso-Sensitest瓊脂平板，孵育16-20h，試驗菌生長情況良好。

陰性對照組：將無菌MH肉湯、MH瓊脂平板和Iso-Sensitest瓊脂平板置於與實驗組試管/瓊脂平板相同條件下，孵育16-20h，無細菌生長。

試驗結果

F10SC在MH肉湯中的最低抑菌濃度

表1

+++ 表示以肉眼觀察試驗菌生長情況良好

- 表示以肉眼觀察無細菌生長

F10SC的最低抑菌濃度

結果的重複性：銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的試驗結果與此前相同條件下進行的試驗結果一致。

擴散法試驗結果

所有試驗菌均在F10SC消毒劑的1:250倍肉湯稀釋液中表現出敏感性，在該濃度乃至更低濃度下，均可觀察到明顯的完全抑制。耐藥菌株，如銅綠假單胞菌和大腸桿菌，當F10SC藥敏紙片濃度相當於1:250倍肉湯稀釋液時，在瓊脂上產生了較小的抑菌圈，在F10SC的1:1000和1:4000倍肉湯稀釋液中被完全抑制。敏感菌株，如金黃色葡萄球菌，當F10SC藥敏紙片濃度相當於1:250倍肉湯稀釋液時，在瓊脂上產生了較大的抑菌圈，在F10SC的1:16000倍肉湯稀釋液中被完全抑制。

抑菌圈的測量

我們對F10SC在不同濃度下對8種試驗菌的效果分別進行了測量，並將抑菌圈的平均大小記錄了下來(單位為mm)。

表2 - 採用MH瓊脂

表3 - 採用Iso-Sensitest瓊脂

MH瓊脂

Iso-Sensitest瓊脂

- 結論 -

1) 在兩種類型的培養基上均觀察到所有試驗菌生長情況良好。為了使菌落數量處於藥敏紙片上所含抗菌劑的處理能力範圍內，最終試驗用的菌懸液稀釋液必須嚴格控制在0.5個麥氏標準，即細菌近似濃度為1.5x10^8cfu/ml。

2) 在MH瓊脂平板上，革蘭氏陽性和陰性試驗菌的抑菌圈總體上都邊緣清晰、輪廓分明，幾乎沒有發生變形，即使當F10SC的濃度很高時也不例外。但瓊脂平板厚度必須控制在4mm左右並保持表面平整。

3) 在Iso-Sensitest瓊脂平板上，當F10SC濃度較高時部分試驗菌出現了一個問題——經孵育後，金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈出現了嚴重變形和重疊。對應的F10SC濃度分別為1/125、1/500、1/1000和1/2000的藥敏紙片不可在Iso-Sensitest瓊脂上進行上述試驗菌的藥敏試驗。只有當F10SC濃度降至1/4000和1/8000時，抑菌圈的變形才會減輕到可以進行測量的程度。

4) 推薦使用MH瓊脂進行F10SC的藥敏試驗。

5) 當使用超過10µl的溶液製作藥敏紙片時，會導致抑菌圈出現變形，因為紙片的吸收能力有限，難以完全吸收這麼多的液體。

6) 本研究僅選用特定細菌的其中一種分離菌株進行了試驗。由於物種內部的差異性，當前無法以菌群為單位確定耐藥(Resistant)、中敏(Intermediate)和敏感(Susceptible)三者的抑菌圈直徑範圍。本次F10SC藥敏試驗中推薦使用的紙片瓊脂擴散法，也可用於對某一菌種的多種分離株進行耐藥篩選試驗，為耐藥分離株建立抑菌圈直徑範圍。

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