細菌耐藥性試驗測定MIC值綜述

　　1引言

　　細菌感染威脅著人類的生存。1928年Flemming發現了青黴素,1941用於臨床,細菌性疾病的治療從此進入了抗生素時代。抗生素這一「神奇的藥物」曾使人類有效控制了許多可怕的細菌感染性疾病,發病率和死亡率明顯下降。然而進入20世紀80年代,細菌感染並不因為抗菌藥物的廣泛使用而減少,而是出現了更多的細菌感染;更令人擔憂的是,越來越多的細菌產生了耐藥性,甚至多重耐藥性,變得愈加難以對付,成為人類健康事業面臨的嚴重問題之一。

　　2細菌耐藥性

　　耐藥性(drug resistance)是指細菌對藥物所具有的相對的抵抗力。耐藥性的程度依該藥對細菌的最小抑菌濃度(MIC)表示。

　　3細菌耐藥的基因機制

　　根據遺傳特性，將細菌耐藥性分為兩類

　　3.1固有性耐藥

　　來源於該細菌本身染色體上的耐藥基因,代代相傳,具有典型的種屬特異性。

　　3.2獲得性耐藥

　　由於細菌在生長繁殖過程中，其DNA發生改變而使其形成獲得了耐藥性

　　4.細菌耐藥性試驗必要性

　　細菌耐藥性監測對準確掌握細菌對抗菌藥物的耐藥動向和耐藥性變遷，並指導臨床合理用藥具有重要的意義。近年來抗菌藥物的廣泛應用，引起了耐藥菌株的大量產生。但新的抗感染藥品問世速度遠趕不上細菌變異產生的耐藥性速度。還有新發傳染病及其病原體的不斷湧現都說明了細菌耐藥性試驗的重要性。

　　5.耐藥性試驗原理

　　測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用的方法稱為藥物敏感性試驗，簡稱藥敏試驗。

　　6.常規藥敏試驗的選藥原則

　　(1)選擇原則應考慮到藥物臨床療效、耐藥菌株流行情況、預防耐藥菌株產生和經濟的綜合因素，最終目的是達到控制感染。

　　(2)所選藥物應包含於本單位的處方手冊中。

　　(3)結合所在醫療機構的類型、規模及病人的構成情況。

　　7.常規抗生素種類

分類

名稱

β-內醯胺類

青黴素類、頭孢菌素類

大環內酯類

紅黴素、螺旋黴素等。

氨基糖苷類

鏈黴素、慶大黴素

四環素類

四環素、強力黴素等

氯黴素類

包括氯黴素、甲碸黴素

化學合成的抗菌藥物

磺胺類、喹諾酮

其他

抗結核藥、多粘菌素類、萬古黴素

　　8.細菌耐藥性實驗方法種類

　　8.1紙片擴散法

　　含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解後便不斷地向紙片周圍區域擴散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度範圍內的細菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，並與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

　　8.2 E-test法

　　E試條是一條 5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有預先製備的，濃度呈連續指數增長稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度。將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關。

　　8.3稀釋法

　　以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養基進行一系列不同倍數稀釋(通常為雙倍稀釋)，經培養後觀察最低抑菌濃度。包括肉湯稀釋法、微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。

　　8.3.1瓊脂稀釋法

　　瓊脂選擇法是將藥物混勻於瓊脂培養基中，配製含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細菌，經孵育後觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得MIC。結果判斷將平板置於暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度(磺胺可見少許散在細菌生長)。

　　試驗菌的結果報告可用MIC(μg/mL)或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報告。

　　「敏感」即表示測試菌可被測定藥物常規劑量給藥後在體內達到的血藥濃度所抑制;「耐藥」即表示測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效;「中介」者提示該細菌對常規用藥體液或組織中的藥物濃度的反應率低於敏感株，使用高於正常給藥量有療效。

　　8.3.2實驗步驟舉例

　　烏梅對308株臨床菌株的抑菌效果

　　(1)藥液稀釋

　　排列無菌試管10隻,於2～10 只管中加無菌蒸餾水10 mL,取50%(1∶2)烏梅水煎液20 mL,於第一管加入10 mL,第2 管加入10 mL,於第2 管混合後取出10 mL,加入第3 管,再混合後取10 mL 放入第4 管,如此連續稀釋至第9 管取出10 mL 棄掉。第10 管只有無菌蒸餾水作對照。這樣1～9管中含有不同濃度藥液各10 mL。

　　(2)含藥平板製備

　　將已溶化的無菌M-H 瓊脂900 mL 分裝於10瓶,每瓶90mL,將第1管含10 mL 50%的烏梅水煎液放入含90mL 培養基的瓶中,混合後傾注4個平板,每個平板含25 mL 含藥瓊脂,第2管以後的平板製備同第1管,凝固後備用。這樣第1組的瓊脂平板實際含烏梅5%(1∶20),第2 組為1∶40,第3 組為1∶80。含藥培養基的藥物濃度計算：將一定量(50 mL 或100 mL)、一定比例(1∶2 或1∶4)的原藥材水煎液於37 ℃溫箱中烘乾,稱重,求出每1 mL 水煎液的實際重量,就可算出每1 mL 培養基中水煎藥液乾重量。如每100 mL 50%烏梅煎液乾重為11500 mg,第1組每100 mL含藥培養基含有煎液10 mL,那麼每1 mL 培養基含煎液乾重則為：

　　所以第1組含藥培養基實際含煎劑乾重為11.5 mg/mL,因倍量稀釋,故第2組含藥培養基為第1組數被2除即可。烏梅水煎劑即：1∶20=11.5 mg/mL,1∶40=5.75 mg/mL,1∶80=2.88 mg/mL??。

　　(3)菌液製備

　　將金黃色葡萄球菌等新鮮培養物(菌落)製成菌液,濃度相當於0.5麥氏比濁管。

　　(4)指標檢測

　　用多點接種儀分別吸取各種菌液並將其點種於含不同藥物濃度瓊脂平板上。於35 ℃培養18～24 h,觀察最低抑菌濃度

　　8.3.3瓊脂稀釋法優缺點

優點

缺點

l        精確可靠

l        可同時測定多株菌（40株）

l        細菌生長情況可查

l        測多個藥時勞動強度大

l        製備平皿費時費力

 

　　9細胞多點接種儀

　　9.1選購多點細胞接種儀的必要性

　　根據現有大量的具有強耐藥性細菌的出現，被測試的藥物種類以及其濃度範圍都再不斷的擴大，這都加重了實驗人員的工作量，這也是瓊脂稀釋法最大的缺點，另外傳統的接種方法，接種效果較差，準確性和重複性都很低。

　　9.2儀器介紹

　　我公司自主研發的HMI-60型多點種儀為細菌耐藥性實驗量身打造的儀器，可以在9秒鐘內自動進行並完成接種，且一次性可進行多種藥物及其不同濃度的接種試驗。打破了傳統人工接種模式，採用全自動機械接種，使接種過程簡單、快速，準確。

　　9.3主要特點

　　l 接種棒使用經特殊處理的不鏽鋼製成，由於專門的結構設計和特殊加工，消除了接種棒的疏水性並防止了採樣時菌液滴落。

　　l 具有位置判定針，培養皿上的菌落位置很容易判定，滅菌處理方法簡單。

　　l 接種速度極快，減輕工作強度並避免操作誤差。

　　l 採菌液量準確重現性高，可靠性高的檢測手段，採菌量準確確保所有接種棒在培養皿上成功接種。

　　l 操作簡單快速接種速度快且可調，實現了快速檢測菌液稀釋的簡易操作，減輕工作強度並避免操作誤差。

　　l 獨特的可調速旋轉式樣品託盤可實現自動定位無需操作只需要更換樣品即可完成接種，極大的縮短了操作時間，滿足了實驗室自動化的要求。

　　l 一次性可接種60種藥物

　　9.4技術參數

名稱

 

參數

接種時間（s）

9或13

儀器重量（kg）

12

功率（w）

120

外形尺寸（mm）

335×250×415

接種菌液量（µL）

5（24位）或1（60位和96位）

接種培養皿（mm）

90

電源（v）

220

接種針直徑

24位3mm、60位和96位1.6mm

　　9.5採購指南

　　HMI系列多點接種儀根據接種針數目不同分為HMI-24、 HMI-60和HMI-96.其中HMI-24的接種菌液量為3µL，而其它兩種均為1µL，可根據實驗中配置系列藥物濃度的多少進行選擇。

　　9.6與傳統接種方式對比優勢

　　克服了傳統細菌接種方法的諸多缺點，如由於接種環結構以及每個接種環之間的差異而導致採菌液量不準確和由於重複性差所導致的裁定藥物抗菌濃度的不準確等缺點。

　　9.7配套裝置指南

　　標配：24位接種架(含24支接種棒，1支位置針，24位樣本定位盒);60位接種架(含60支接種棒，1支位置針，60位樣本定位盒);選配：96位接種架(含96支接種棒，96位樣本定位盒)。

　　9.8已使用客戶

　　上海市疾控中心、上海交通大學、湖南食品和藥品檢驗所等。

　　9.9應用領域

　　主要用於細菌耐藥性實驗。廣泛應用於藥物檢測，藥品生產、藥物研發、疾病防控等醫藥領域。

　　9.10瓊脂稀釋法舉例

　　(1)《阿莫西林-雙氯西林的體外抗菌作用研究》

　　在對阿莫西林-雙氯西林的體外抗菌作用研究中，收集臨床分離菌按CL SI/ NCCLS推薦的瓊脂對倍稀釋法測定阿莫西林-雙氯西林的最低抑菌濃度,並與相關抗菌藥物進行比較。MIC的測定方法為按 NCCLS2005 年版推薦的瓊脂對倍稀釋法測定9 種抗菌藥的最低抑菌濃度。抗菌藥的保存液和工作液配置均按CL SI/NCCLS 2005年版的描述進行。藥物濃度從128～0.06 mg/L共12個對倍稀釋度，細菌的接種菌量為104CFU/點。使用多點接種器接種35℃培養16～18h。

　　(2)《2002-2003年中國革蘭陰性細菌耐藥性監測研究》

　　在對2002-2003年中國革蘭陰性細菌耐藥性監測研究中，採用國際標準平皿二倍稀釋法進行體外敏感試驗,測得MIC50、MIC90表示抗菌藥物的抗菌活性。最低抑菌濃度(MIC)測定:用標準瓊脂二倍稀釋法測定MIC，根據不同菌種選擇適宜培養基。用多點接種儀定量接種細菌，根據所測每株菌 MIC值，計算 MIC50與 MIC90，並按 NC CLS 2002 規定的臨界濃度，判定每株菌對抗菌藥物的敏感度，求出各類細菌對所測定的各種抗菌藥物的R %、I%和S%。

　　(3)《利奈唑胺對萬古黴素敏感及耐藥屎腸球菌的抗菌活性》

　　在對利奈唑胺對萬古黴素敏感及耐藥屎腸球菌的抗菌活性研究中，多重的PCR 法鑑定屎腸球菌萬古黴素耐藥基因類型，平皿二倍稀釋法測定利奈唑胺等11種抗菌藥物MIC值。採用標準平皿二倍稀釋法。被試菌懸液用多點接種儀接種，每點接種量為104CFU/mL。按照CLSI判定細菌對各種抗菌藥物的敏感、中介和耐藥率，其中高濃度慶大黴素和高濃度鏈黴素敏感性的判斷標準為：慶大黴素≤500mg/L為敏感，>500mg/為耐藥;鏈黴素≤2000mg/L為敏感，>2000mg/L為耐藥。

　　(4)《腸桿菌科細菌質粒介導的喹諾酮耐藥機制》

　　中國九家教學醫院腸桿菌科細菌質粒介導的喹諾酮耐藥機制研究中，究質粒介導的喹喏酮類的耐藥基因qnr和缸aac(6』)-lb-cr在我國腸桿菌科臨床株中的分布狀況。其方法主要分為qur篩選、aac(6』)-lb-cr的檢測和質粒接合實驗，其中在在篩選平皿上生長的菌落同時採用細胞接種儀接種至含及不含環丙沙星(0.05µg/mL)的M-H平皿，以了解喹諾酮類耐藥是否同時轉移。

　　(5)《烏梅對308株臨床菌株的抑菌效果》

　　在對烏梅對308株臨床菌株的抑菌效果研究中，採用瓊脂稀釋法對烏梅進行308株臨床菌株的抑菌活性檢測，採用多點接種儀進行指標檢測，具體步驟為用多點接種儀分別吸取各種菌液並將其點鐘於含不同藥物濃度瓊脂板上。於35℃培養18-24h,觀察最低抑菌濃度(MIC)，並統計出MIC50和MIC90的藥物濃度和累積抑菌百分率。

　　(6)《苦參、黃芩、烏梅對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌抗菌活性研究》

　　在對苦參、黃芩、烏梅對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌抗菌活性的研究中，採用M-H瓊脂連續稀釋法做抗菌作用測定，測出各中藥的最小抑菌濃度。在進行MIC測定時使用多點接種儀分別吸取各種受試菌菌液並在15min內將其點種於含不同藥物的瓊脂板上，於37℃在培養箱中培養18-24h，觀察含藥平板的菌落生長情況，根據含藥平板的菌落抑制數，以平板內細菌全部被抑的藥物最低濃度作為對該菌株的最小抑菌濃度即MIC值。

　　10稀釋法舉例

葡萄球菌屬液體稀釋法、瓊脂稀釋法

 

試驗條件

培養基

肉湯稀釋法：CAMHB；2％NaCL+CAMHB 用於檢測苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林；

瓊脂稀釋法：Mueller-Hinton瓊脂；2％NaCL+MHA用於檢測苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林

接種物

直接菌落懸液法，相當於0.5麥氏標準。

孵育

35±2℃；空氣；16－18 小時；測苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和萬古黴素需24 小時。試驗溫度超過35℃不能檢測MRS。

推薦的質控菌株

金黃色葡萄球菌ATCC29213；大腸埃希菌ATCC 35218（為監控β-內醯胺酶/β-內醯胺抑制劑紙片用）；金黃色葡萄球菌ATCCBAA-977 和金黃色葡萄球菌ATCCBAA-976（用於克林黴素誘導試驗質量評估）

幽門螺桿菌的瓊脂稀釋法

試驗條件

培養基

Mueller-Hinton瓊脂+5%羊血

接種物

生長法或直接菌落懸液法，相當於2麥氏標準。

孵育

35℃±2℃；微需氧；3天

推薦的質控菌株

幽門螺桿菌ATCC43504

霍亂弧菌紙片擴散法、液體稀釋法、瓊脂稀釋法

試驗條件

培養基

Mueller-Hinton瓊脂，CAMHB,MHA

接種物

生長法或直接菌落懸液法，相當於0.5麥氏標準。

孵育

35℃±2℃；空氣；16-18小時

推薦的質控菌株

大腸埃希菌ATCC25922

腦膜炎奈瑟菌紙片擴散法、液體稀釋法、瓊脂稀釋法

試驗條件

培養基

含5%綿羊血的Mueller-Hinton 瓊脂；CAMHB+2~5%融解的馬血；MHA+5％脫纖維羊血

接種物

直接菌落懸液法，相當於0.5 麥氏標準（紙片擴散法）；來自20-24小時CO2環境巧克力平板的直接菌落懸液法，相當於0.5 麥氏標準（液體稀釋法、瓊脂稀釋法）。

孵育

35℃±2℃；5%CO2；20-24 小時

推薦的質控菌株

肺炎

鏈球

菌ATCC49619，5%CO2 環境；大腸埃希菌ATCC25922（在空氣或5%CO2 環境）用於環丙沙星、萘啶酸和米諾環素監控

腸球菌屬紙片擴散法、液體稀釋法、瓊脂稀釋法

試驗條件

培養基

Mueller-Hinton瓊脂，CAMHB,MHA

接種物

生長法或直接菌落懸液法，相當於0.5麥氏標準。

孵育

35℃±2℃；空氣；16-18小時；測萬古黴素需24小時

推薦的質控菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923(Mueller-Hinton瓊脂);糞腸球菌ATCC29212