【實驗目的】
（1）學習水中細菌總數和大腸菌群數量測定的方法。
（2）了解大腸菌群指數在飲用水細菌學檢查中的重要性。
【實驗原理】為檢驗飲用水是否達到衛生標準，需要進行水中的細菌數量及大腸菌群數的測定。細菌總數可以說明水質被汙染的程度，一般來說，細菌數量越多，汙染的程度越高。大腸菌群是大量出現在糞便中的非致病菌，從其數量的多少可判斷水源被人畜排洩物汙染的程度，所以大腸桿菌可作為糞便汙染的指示菌。國家飲用水標準規定，飲用水中大腸菌群數不超過3CFU/L，細菌總數不超過100CFU/mL。2005年6月開始，城市供水衛生標準有所提高，自來水中細菌菌落數不得超過80CFU/mL，任意取100mL水樣不得檢出大腸桿菌。因此，對水中的細菌數量及大腸菌群數的檢驗是保證飲用水安全和控制傳染病的有效手段，同時也是評價水質狀況的重要指標。本實驗採用平板菌落計數法測定水中細菌總數。其方法是將待測樣品經適當稀釋，塗布在平板上，經培養後在平板上形成肉眼可見的菌落。統計菌落數，根據稀釋倍數和取樣量計算出樣品中的細菌數量。平板菌落計數法由於計算的是平板上形成的菌落數，故其反映的是樣品中活菌的數量，又稱活菌計數法。另外，由於樣品往往不易完全分散成單個細胞，平板上形成的每個菌落不一定是單個細胞生長繁殖而成，有的可能來自兩個或多個細胞，故平板菌落計數法使用菌落形成單位（colony-forming unit, CFU），而非絕對細菌數量。水中大腸菌群數量的測定可採用多管發酵法或濾膜法。其中，多管發酵法是最通用的方法。其原理是，利用大腸菌群發酵乳糖產酸、產氣的生理特點，將水樣根據含菌量做適當稀釋後，接種到乳糖蛋白腖發酵液中，經37℃培養24h後，如果試管中發酵液由紫色變為黃色，且小管內有氣體產生，說明產酸、產氣，判為陽性；若24h後尚未產氣，可能由於菌量少，可繼續培養到48h，判定結果為可疑；若既不產酸，也不產氣，判為陰性。此法適用於各種水樣的檢測，但操作繁瑣，需要時間長。相比較而言，濾膜法操作簡便、快速。該法是採用一種孔徑約0.45μm的多孔硝化纖維膜或乙酸纖維膜濾膜過濾器過濾水樣，使其中的細菌截留在濾膜上，然後將濾膜放在適當的培養基上進行培養，大腸菌群可直接在膜上生長，從而可直接計數。此法僅適用於水質較好、體積較大的水體，如大城市的水廠常採用此法，但不適用於雜質較多、易於阻塞濾孔的水樣。
【實驗器材】
1．實驗材料自來水、池水、河水或湖水。2．培養基牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、復紅亞硫酸鈉培養基（遠藤氏培養基）、乳糖蛋白腖水培養基（內含倒置杜氏小管）、三倍濃縮乳糖蛋白腖水培養基（內含倒置杜氏小管）、伊紅美藍培養基（EMB培養基）。
2．試劑無菌水等。
3．器皿內裝9mL無菌水的試管、內裝50mL無菌水的三角燒瓶、無菌帶玻璃塞瓶、無菌培養皿、無菌吸管、微孔濾膜（孔徑0.45μm）、過濾器（容量500mL）、抽氣設備、鑷子、移液管、接種環、酒精燈等。
【實驗步驟】
1．水樣的採取
（1）自來水先將自來水龍頭用火焰灼燒3min滅菌，再開放水龍頭使水流5min，以無菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。
（2）池水、河水或湖水取距水面10～15cm水層的水樣。先將無菌的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然後翻轉過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿後，將瓶塞蓋好，再從水中取出。注意：採來的水樣最好立即用於檢測，否則需放入4℃冰箱中暫時保存。
2．細菌總數測定
（1）自來水
1）加樣：用無菌吸管吸取1mL水樣，注入無菌培養皿中。每個水樣重複三皿。2）制平板：分別傾注約15mL已溶化並冷卻到45℃左右的牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基，蓋上皿蓋，立即輕輕旋轉搖動，使水樣與培養基充分混勻，平放待凝。另取一空的無菌培養皿，傾注牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基15mL，作空白對照。3）培養：平板凝固後，倒置於37℃培養箱中，培養24h。
（2）池水、河水或湖水
1）稀釋水樣：取3支裝有9mL無菌水的試管，加入1mL水樣，依次稀釋到10-3。注意：稀釋倍數視水樣汙濁程度而定，以培養後平板的菌落數在30～300個之間的稀釋度最為合適。若一般中等汙穢水樣，可取10-1、10-2、10-3稀釋度；汙穢嚴重的水樣，取10-2、10-3、10-4甚至更高的稀釋度。2）加樣：取適當稀釋度水樣1mL加入空的無菌培養皿中，每一稀釋度做2個重複。3）以下步驟與「自來水」的方法相同。
（3）菌落計數
1）首先選擇平均菌落數在30～300個之間的，當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此範圍時，則該平均菌落數乘以稀釋倍數即為該水樣的細菌總數（附表11-1中例1）。2）若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30～300個之間，則按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小於2，應取兩者的平均數；若大於2，則取其中較小的菌落總數（附表11-1中例2及例3）。3）若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數計算（附表11-1中例4）。4）若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算（附表11-1中例5）。5）若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300個之間，則以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數計算（附表11-1中例6）。注意：同一稀釋度的兩個平板，若其中一個平板有較大片狀菌苔生長，則不應採用，而以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數；若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其餘的一半菌落分布又很均勻時，則可將此一半的菌落數乘2以代表整個平板的菌落數。以上平板菌落計數的方法如圖11-1所示。
3．大腸菌群指數測定
（1）多管發酵法（圖11-2）
1）自來水①初發酵：取2個裝有50mL三倍濃縮乳糖蛋白腖水培養基的三角燒瓶，各加入100mL水樣；取10支裝有5mL三倍濃縮乳糖蛋白腖水培養基的試管，各加入10mL水樣。混勻後，於37℃培養24h（24h未產氣的繼續培養至48h）。②平板分離：將24h培養後產酸、產氣及48h培養後產酸、產氣的發酵管（瓶）中的菌液，分別劃線接種於伊紅美藍瓊脂平板上，於37℃培養18～24h，將符合下列特徵的菌落進行塗片、革蘭氏染色和鏡檢：（a）深紫黑色、有金屬光澤；（b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤；（c）淡紫紅色、中心顏色較深。③復發酵：經塗片、染色和鏡檢後，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落，重新接種於普通濃度的乳糖蛋白腖水培養基試管中，每管可接種同類型菌落1～3個，於37℃培養24h，若結果是產酸又產氣，即證實有大腸菌群存在。根據初發酵試驗的陽性管（瓶）數查附表11-2，即得大腸菌群數。
2）池水、河水或湖水①稀釋水樣：將水樣稀釋成10-1與10-2。②初發酵：分別吸取1mL10-2、10-1的稀釋水樣和1mL原水樣，注入裝有10mL普通濃度乳糖蛋白腖試管中。另取10mL和100mL原水樣，分別注入裝有5mL和50mL三倍濃縮乳糖蛋白腖水培養基的試管和三角燒瓶中。③以下步驟同上述「自來水」的平板分離和復發酵試驗。所加水樣體積為100、10、1、0.1mL的發酵管結果查附表11-3；水樣體積為10、1、0.1、0.01mL的發酵管結果查附表11-4，即得每升水樣中的大腸菌群數。
1）濾膜準備：將濾膜放入裝有蒸餾水的燒杯中，加熱煮沸15min，共煮沸三次，前兩次煮沸後換水洗滌兩三次再煮，以洗去濾膜上殘留的溶劑。2）濾膜過濾器裝置：將已滅菌的過濾器基座、濾膜、漏鬥和抽濾瓶按圖11-3所示裝配好，抽濾瓶接上真空泵。注意：濾膜用無菌鑷子移至過濾器的基座上，其他可直接用手或夾鉗操作，但不要碰到伸入抽濾瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
2）加水樣過濾：過濾器漏鬥內加入河水或湖水100mL，加蓋。開動真空泵進行抽濾。抽完後，加入等量的無菌水繼續抽濾，目的是衝洗漏鬥壁。注意：直徑為35mm的濾膜所過濾的水量以培養後長出的菌落數不多於50個為適宜。一般清潔的深井水或經處理過的河水與湖水等可取樣300～500mL；比較清潔的河水或湖水可取樣100mL；嚴重汙染的水樣可先進行稀釋；未知的水樣可做3個稀釋度，選擇菌落數合適的稀釋度進行計算。
4）平板培養：用無菌鑷子取濾膜邊緣，將沒有細菌的一面緊貼在遠藤氏瓊脂平板或伊紅美藍瓊脂平板上。平板倒置於37℃下培養22～24h，培養結果參見圖11-4。注意：濾膜與培養基之間不得有氣泡。
5）革蘭氏染色：挑取符合大腸菌群特徵的菌落（參閱多管發酵法），進行革蘭氏染色並鏡檢。6）發酵試驗：將鏡檢結果為革蘭氏陰性、無芽孢桿菌的菌落再接入乳糖蛋白腖水培養基試管，經37℃培養24h，若產酸又產氣，即為大腸菌群陽性。
7）計算：1L水樣中的大腸菌群數＝濾膜上的大腸菌群菌落數×10
【實驗報告】
1．實驗結果將各水樣的細菌總數和大腸菌群測試結果記錄在下表中，並對所測水樣作出評價。
表11-1 水樣的細菌總數和大腸菌群測試結果
2．思考題
（1）從測定的細菌總數結果來看，自來水是否符合飲用水標準？在不同的地方，這種測定條件能否根據實際情況（諸如培養溫度、培養時間等）加以改變？為什麼？
（2）比較多管發酵法與濾膜法測定大腸菌群的結果。它們各有何優缺點？
附表11-1 計算菌落總數方法
附表11-2 大腸菌群檢數表
附表11-3 大腸菌群檢數表
註：「＋」表示大腸菌群發酵陽性；「—」表示大腸菌群發酵陰性附
表11-4 大腸菌群檢數表