噬菌體的分離純化及效價測定——萬融實驗

2020-12-06 實驗室小知識

【實驗目的】

（1）學習分離純化噬菌體的基本原理和方法。

（2）掌握噬菌體效價測定的方法。

【實驗原理】

噬菌體是一類專性寄生於原核細胞內的病毒。自然界中凡是有細菌和放線菌分布的地方，總可分離獲得相應特異性的噬菌體。例如，糞便與陰溝汙水中含有大量的大腸桿菌噬菌體；乳牛場有較多的乳酸桿菌，容易獲得乳酸桿菌噬菌體。樣品中加入敏感菌株與液體培養基混合後培養，噬菌體便能大量增殖、釋放，從而可分離到特定的噬菌體。圖14-1是常見的噬菌體類型。

圖14-1　噬菌體（引自M．T．馬迪根）a．噬菌體主要類型模式圖；b．E．coli噬菌體T4電子顯微鏡照片

噬菌體的效價是指每毫升樣品中所含具有感染性噬菌體的粒子數。噬菌體個體極其微小，專營細胞內寄生生活，用常規的微生物計數法無法測得其數量。由於噬菌體對其宿主細胞的裂解，在含有敏感菌株的平板上會出現肉眼可見的噬菌斑，一般一個噬菌體粒子形成一個噬菌斑，因此可根據一定體積樣品所形成的噬菌斑數計算出噬菌體的效價。但是，樣品中可能會有少數活噬菌體未能引起侵染，使噬菌斑計數結果往往比實際活噬菌體數偏低。因此，噬菌體的效價一般不用噬菌體粒子的絕對數量表示，而是採用噬菌斑形成單位（plaque-forming unit, PFU）表示。本實驗是從陰溝汙水中取樣和分離大腸桿菌噬菌體，並用雙層平板法測定其效價。

【實驗器材】

1．實驗材料大腸桿菌斜面、含有噬菌體的陰溝汙水樣品。

2．培養基上層牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基（含瓊脂0.6％分裝試管4mL）、底層牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基（含瓊脂1.5％～2％）、牛肉膏蛋白腖水，培養基、三倍濃縮牛肉膏蛋白腖水培養基。

3．儀器和用具無菌吸管、無菌平皿、無菌抽濾瓶、三角塗棒、錐形瓶、恆溫水浴鍋、細菌過濾器等。

【實驗步驟】

1．噬菌體的分離

（1）製備菌懸液：取大腸桿菌斜面（於37℃培養18～24h）1支，加4mL無菌水洗下菌苔，製成菌懸液。

（2）增殖噬菌體：取汙水樣2mL，置於三角燒瓶內，加入100mL三倍濃縮牛肉膏蛋白腖水培養基及2mL大腸桿菌菌液，於37℃振蕩培養12～24h。注意：最好選取天然汙水，如河水等。

（3）製備噬菌體裂解液：將上述培養液離心（2500r/min）15min，所得上清液用細菌過濾器過濾。取少量過濾液接入牛肉膏蛋白腖水培養基中，37℃培養過夜，以做無菌檢查。若無細菌生長，表明菌已除盡。注意：過濾除菌時一定要做到無菌操作。

（4）噬菌體的檢測：於牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平板上滴加大腸桿菌菌懸液一滴，用無菌塗棒塗布成一薄層。待平板上菌液幹後，滴加上述濾液數小滴於平板面上，將平板置於37℃培養過夜。如濾液內有大腸桿菌噬菌體存在，加濾液處便出現無菌生長的蠶食狀透明斑。

2．噬菌體的純化和增殖

（1）噬菌體樣品的稀釋：將已證明含有噬菌體的濾液用牛肉膏蛋白腖水培養基按10倍稀釋法稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度。

（2）倒底層平板：取直徑9cm的平皿5隻，每皿倒入約10mL底層瓊脂培養基，依次標明10-1、10-2、10-3、10-4和10-5。

（3）製備上層混合液：取5支試管，依次標明10-1、10-2、10-3、10-4和10-5分別向每支試管中加入0.2mL對數期的大腸桿菌菌液，並對號加入0.1mL各稀釋度的噬，菌體濾液，搖勻，37℃保溫5min。

（4）倒上層平板：將製備好的上層混合液分別加到含4mL50℃保溫的上層瓊脂培養基試管中，充分搖勻，然後對號倒入底層瓊脂已凝固的平板上，待上層瓊脂凝固後，置於37℃培養18～24h。注意：上層培養基瓊脂的濃度（0.6％）十分重要，過高或過低對形成噬菌斑均有較大的影響。

（5）噬菌體的純化：在噬菌斑分布較分散的平板上，用接種針挑取典型（圓形）的噬菌斑，接種於含有大腸桿菌的牛肉膏蛋白腖水培養基中，37℃培養18～24h，再依上述方法進行分離純化，直到平板上出現的噬菌斑的形態、大小完全一致（圖14-2）。

圖14-2　噬菌體效價測定（引自M．T．馬迪根）a．雙層平板法操作步驟；b．噬菌斑

（6）噬菌體增殖：將純化的噬菌體裂解液按約1∶4的比例加入對數期大腸桿菌菌液中，37℃振蕩培養24～48h，使噬菌體增殖。如此重複數次，可得到高效價的噬菌體。

3．噬菌體效價的測定

（1）敏感菌活化：將大腸桿菌接入裝有20mL牛肉膏蛋白腖水培養基的錐形瓶中，30℃振蕩培養12～16h。

（2）倒底層培養基：將底層培養基融化後按每皿10mL倒底層平板，共12個，分別標記10-7、10-8、10-9和對照，每種各3皿。

（3）噬菌體稀釋：取0.5mL噬菌體濃縮液（增殖液），加到含4.5mL牛肉膏蛋白腖水培養基的試管中進行10倍系列稀釋，依次稀釋到10-9稀釋度。

（4）噬菌體與菌液混合：取12支無菌空試管分別標記為10-7、10-8、10-9和對照各3支。用無菌吸管分別取10-7、10-8、10-9稀釋度噬菌體各0.1mL加入相應標記的無菌空試管內（每個稀釋度3個重複），在對照管中加入0.1mL無菌水。然後在上述各試管中分別加入0.2mL大腸桿菌菌液，震蕩試管使之混合，於37℃水浴中保溫5min。注意：噬菌體與細胞的比例。測定噬菌體效價應採用低感染複數，指示菌的細胞密度不宜過高，一般控制在1×107個/mL為宜。

（5）加上層培養基：取50℃保溫的上層培養基5mL分別加入上述各試管中，立即旋搖混勻，再快速倒入相對應編號的底層培養基平板上，放在檯面上搖勻，使上層培養基鋪滿平板，凝固後，於37℃培養24h。注意：倒上層培養基時速度要快。

（6）統計噬菌斑：仔細觀察平板上形成的噬菌斑，記錄結果。

【實驗報告】

1．實驗結果

（1）將各平板上的噬菌斑數記錄於下表。

表14-1　平板上的噬菌斑數

（2）從上表中選取一組噬菌斑數在30～300個間的數值來計算噬菌體樣品中的效價值。計算公式如下：

式中：N為效價值；Y為平均每皿噬菌斑數（PFU）；X為稀釋度；V為取樣量，單位為mL。例如，當稀釋度為10-8時，取樣量為0.1mL/皿，同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個，則該樣品的效價為：

2．思考題

（1）噬菌體效價的涵義是什麼？有幾種表示法？用哪一種方法測得效價更準確？為什麼？

（2）要證實獲得的噬菌體裂解液中確有噬菌體存在，除用本實驗使用的雙層平板法觀察噬菌斑外，還可以用什麼方法予以證實？

（3）試比較分離純化噬菌體與分離純化細菌在基本原理和具體方法上的異同。（陳宜濤）

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