土壤微生物的分離純化及菌落觀察——萬融實驗

2020-12-08 實驗室小知識

【實驗目的】

（1）掌握倒平板的方法和幾種分離純化微生物的基本操作技術。

（2）了解四大類微生物的菌落特徵。

【實驗原理】

土壤是微生物生活的大本營。土壤中的微生物無論是數量和種類都是極其多樣的，因此，土壤是我們開發利用微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化到許多有用的菌株。在土壤中，不同種類的微生物絕大多數都是混雜生活在一起的。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離純化。其基本原理主要包括兩個方面：一是選擇適合於待分離微生物的生長條件，或加入某種抑制劑，造成只利於待分離微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從而淘汰大部分不需要的微生物；二是微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲得單菌落的方法可通過稀釋塗布平板法或平板劃線法等技術來完成。單個菌體經生長繁殖，在固體培養基表面生成成堆的細胞群，稱為菌落（colony）。不同微生物的菌落具有不同的特徵，是形態分類的指標之一。細菌菌落一般呈溼潤、光滑、較透明、較黏稠、易挑取等特點；放線菌菌落一般呈乾燥、不透明、緻密、難挑取等特點；酵母菌菌落一般較溼潤、光滑、黏稠、易挑取，比細菌菌落大且厚，多呈乳白色，少數呈紅色；黴菌菌落形態較大，質地疏鬆，外觀乾燥，不透明，呈絨毛狀、棉絮狀等，菌落正反面顏色不同。

【實驗器材】

1．實驗材料菜園土壤。

2．培養基高氏1號瓊脂培養基、牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基。

3．試劑10％酚、鏈黴素、無菌水等。

4．儀器和用具無菌玻璃塗棒、無菌吸管、無菌培養皿、盛9mL無菌水的試管、盛90mL無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶。

【實驗步驟】

1．稀釋塗布平板法

（1）倒平板

1）分別將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基、高氏1號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基溶化。2）待培養基冷至55～60℃時，向高氏1號瓊脂培養基中加入10％酚數滴，向馬丁氏培養基中加入鏈黴素溶液（使每毫升培養基中含鏈黴素30μg）。3）倒平板，每種培養基倒三皿，其方法如圖2—7所示。

（2）製備土壤稀釋液

1）稱取土樣10g，放入盛有90mL無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，並使細胞分散。2）用一支1mL無菌吸管從中吸取1mL土壤懸液注入盛有9mL無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。3）以此類推製成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液（圖9—1）。注意：每一稀釋度換一支無菌吸管。

圖9-1　製備土壤稀釋液（引自沈萍）

（3）塗布平板

1）每種培養基的三個平板底部分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀釋度。2）用三支1mL無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.2mL對號放入已寫好稀釋度的平板中。3）用無菌玻璃塗棒在培養基表面輕輕地塗布均勻。

（4）倒置培養1）將高氏1號瓊脂培養基平板和馬丁氏培養基平板置於28℃恆溫培養箱中培養3～5d。2）將牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平板置於37℃恆溫培養箱中培養1～2d。

（5）挑菌接種將培養後長出的單個菌落分別挑取、接種到斜面培養基上，適溫培養，待菌苔長出後，用顯微鏡塗片檢查是否是單一的微生物。若有其他雜菌混雜，就要再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。稀釋塗布平板法的操作流程如圖9-2所示。

圖9-2　稀釋塗布平板法的流程圖（引自M．T．馬迪根）a．將樣品滴加到平板表面；b．用無菌塗棒把樣品均勻塗布到平板表面；c．平板倒置培養；d．典型的塗布平板結果

2．稀釋混合平板法

此法與稀釋塗布平板法基本相同，無菌操作也一樣，所不同的是先分別吸取0.5mL10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液對號放入平皿，然後再倒入溶化後冷卻到45℃左右的培養基，邊倒入邊搖勻，使樣品稀釋液與培養基混合均勻，待冷凝成平板後，分別倒置於28℃或37℃培養箱中培養，再挑取單個菌落，直至獲得純培養。流程如圖9-3所示。

圖9-3　稀釋混合平板法的流程圖（引自M．T．馬迪根）a．將樣品滴加到已滅菌的培養皿中；b．加入無菌的培養基與樣品充分混合；c．平板倒置培養；d．典型的混合平板法結果

3．平板劃線分離法

（1）倒平板同上。（2）劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述10-1的土壤懸液一環在平板上劃線（圖9-4）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置於適溫下培養。

圖9-4　平板劃線示意圖（引自M．T．馬迪根）a．在平板培養基的一邊做第一次平行劃線三四條；b．轉動培養皿約70°角，並將接種環上剩餘物燒掉，待冷卻後通過第一次劃線部分做第二次平行劃線；c．用同法通過第二次平行劃線部分做第三次平行劃線；d．用同法通過第三次平行劃線部分做第四次平行劃線；e．用同法通過第四次平行劃線部分做第五次平行劃線（3）挑菌從劃線分離平板上挑取單菌落（圖9-5），直至獲得純培養。

圖9-5　劃線獲得單菌落（引自M．T．馬迪根）4．辨認菌落通過以上平板塗布或平板劃線，可在相應的平板上獲得細菌、放線菌、酵母菌和黴菌的菌落。觀察這些菌落的形態特徵，並將記錄結果。

【實驗報告】

1．實驗結果

（1）平板分離結果記錄三種培養基平板上長出的菌落分屬於哪個微生物類群。

（2）菌落形態特徵將四大類微生物的菌落的形態特徵填入表9-1中。

表9-1　四大類微生物菌落形態特徵比較

2．思考題

（1）在平板劃線法中，為什麼每次都需將接種環上的剩餘物燒掉？

（2）為什麼要將培養皿倒置培養？

（3）為什麼高氏1號瓊脂培養基和馬丁氏培養基中要分別加入酚和鏈黴素？如果用牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基分離一種對青黴素具有抗性的細菌，你認為應如何做？

（陳　敏）

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