自然界工業菌種的分離篩選

2020-09-09 百歐博偉生物



百歐博偉生物:我國幅員遼闊,各地氣候條件、土質條件、植被條件差異很大,這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環境。自然界中微生物種類繁多,估計不少於幾十萬種,但目前已為人類研究及應用的不過千餘種。由於微生物到處都有,無孔不入,所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居於一起的。而現代發酵工業是以純種培養為基礎,故採用各種不同的篩選手段,挑選出性能良好、符合生產需要的純種是工業育種的關鍵一步。自然界工業菌種分離篩選的主要步驟是:採樣、增殖培養、培養分離和篩選。如果產物與食品製造有關,還需對菌種進行毒性鑑定。

一、採樣

以採集土壤為主。一般在有機質較多的肥沃土壤中,微生物的數量最多,中性偏鹼的土壤以細菌和放線菌為主,酸性紅土壤及森林土壤中黴菌較多,果園、菜園和野果生長區等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中,酵母和黴菌較多。採樣的對象也可以是植物,腐敗物品,某些水域等。採樣應充分考慮採樣的季節性和時間因素,以溫度適中,雨量不多的秋初為好。因為真正的原地菌群的出現可能是短暫的,如在夏季或冬季土壤中微生物存活數量較少,暴雨后土壤中微生物會顯著減少。採樣方式是在選好適當地點後,用無菌刮鏟、土樣採集器等,採集有代表性的樣品,如特定的土樣類型和土層,葉子碎屑和腐質,根系及根系周圍區域,海底水,泥及沉積物,植物表皮及各部,陰溝汙水及汙泥,反色動物第一胃內含物,發酵食品等。

具體採集土樣時,就森林、旱地、草地而言,可先掘洞,由土壤下層向上層順序採集;就水田等浸水土壤而言,一般是在不損土層結構的情況下插入圓筒採集。如果層次要求不嚴格,可取離地面5~15cm處的土。將採集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。採好的樣必須完整地標上樣本的種類及採集日期、地點以及採集地點的地理、生態參數等。採好的樣品應及時處理,暫不能處理的也應貯存於4℃下,但貯存時間不宜過長。這是因為一旦採樣結束,試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態環境,其內部生態環境就會發生變化,微生物群體之間就會出現消長。如果要分離嗜冷菌,則在室溫下保存試樣會使嗜冷菌數量明顯降低。

在採集植物根際土樣時,一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出,浸漬在大量無菌水中約20min,洗去粘附在根上的土壤,然後再用無菌水漂洗下根部殘留的土,這部分土即為根際土樣。

在採集水樣時,將水樣收集於100m1乾淨、滅菌的廣口塑料瓶中。由於表層水中含有泥沙,應從較深的靜水層中採集水樣。方法是:握住採樣瓶浸入水中30~50cm處,瓶口朝下打開瓶蓋,讓水樣進入。如果有急流存在的話,應直接將瓶口反向於急流。水樣採集完畢時,應迅速從水中取出採集瓶並帶有較大的弧度。水樣不應裝滿採樣瓶,採集的水樣應在24h之內迅速進行檢測,或者4℃下貯存。

二、增殖培養

一般情況下,採來的樣品可以直接進行分離,但是如果樣品中我們所需要的菌類含量並不很多,而另一些微生物卻大量存在。此時,為了容易分離到所需要的菌種,讓無關的微生物至少是在數量上不要增加,即設法增加所要菌種的數量,以增加分離的機率。可以通過選擇性的配製培養基(如營養成分、添加抑制劑等),選擇一定的培養條件(如培養溫度、培養基酸鹼度等)來控制。具體方法是根據微生物利用碳源的特點,可選定糖、澱粉、纖維素,或者石油等,以其中的一種為唯一碳源,那麼只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長,而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養基(如結晶紫營養培養基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細菌時,培養基中添加濃度一般為50μg/m1的抗真菌劑(如放線菌酮和制黴素),可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時,通常於培養基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機混合腐質等的浸出汁) 作為最初分離的促進因子,由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型;放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和複雜底物(如幾丁質),因此,大多數放線菌的分離培養是在貧脊或複雜底物的瓊脂平板上進行的,而不是在含豐富營養的生長培養基上分離的;在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制黴菌素或放線菌酮,以抑制真菌的繁殖;此外,為了對某些特殊種類的放線菌進行富集和分離,可選擇性地添加一些抗生素(如新生黴素)。在分離真菌時,利用低碳/氮比的培養基可使真菌生長菌落分散,利於計數、分離和籤定;在分離培養基中加入一定的抗生素如氯黴素、四環素、卡那黴素、青黴素、鏈黴素等即可有效地抑制細菌生長及其菌落形成;抑制細菌的另外一些方法有:在使用平皿之前,將平皿先乾燥3~4天;降低培養基的pH值或在無法降低pH時,加入1:30000玫瑰紅。這樣有利於下階段的純種分離。

三、培養分離

通過增殖培養,樣品中的微生物還是處於混雜生長狀態。因此還必須分離,純化。在這一步,增殖培養的選擇性控制條件還應進一步應用,而且要控制得細一點,好一點。同時必須進行純種分離,常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進行適當稀釋,然後將稀釋液塗布於培養基平板上進行培養,待長出獨立的單個菌落,進行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養基平板,然後用接種針(接種環)挑取樣品,在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法,無論用哪種方法,基本原則是確保培養出單個菌落。組織分離法主要用於食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時,首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進行表面消毒,用無菌水洗滌數次後,移植到培養皿中的培養基上,於適宜溫度培養數天後,可見微生物向組織塊周圍擴展生長。經菌落特徵和細胞特徵觀察確認後,即可由菌落邊緣挑取部分菌種進行移接斜面培養。

對於有些微生物如毛黴、根黴等在分離時,由於其菌絲的蔓延性,極易生長成片,很難挑取單菌落。常在培養基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖,利於單菌落的分離。

四、篩選

經過分離培養,在平板上出現很多單個菌落,通過菌落形態觀察,選出所需菌落,然後取菌落的一半進行菌種鑑定,對於符合目的菌特性的菌落,可將之轉移到試管斜面純培養。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株,它只是篩選的第一步,所得菌種是否具有生產上的實用價值,能否作為生產菌株,還必須採用與生產相近的培養基和培養條件,通過三角瓶的容量進行小型發酵試驗,以求得適合於工業生產用菌種。這一步是採用與生產相近的培養基和培養條件,通過三角瓶的容量進行小型發酵試驗,以求得適合於工業生產用菌種。如果此野生型菌株產量偏低,達不到工業生產的要求,可以留之作為菌種選育的出發菌株。

五、毒性試驗

自然界的一些微生物在一定條件下將產生毒素,為了保證食品的安全性,凡是與食品工業有關的菌種,除啤酒酵母、脆壁酵母、黑麴黴、米麴黴枯草桿菌無須作毒性試驗外,其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗。


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